彭小薇，董 浩，蔣 卉，秦玉明，許冠龍，馮 宇，朱良全，張春燕，范學(xué)政，丁家波*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102600)

布魯菌(Brucella)由英國軍醫(yī)Bruce于1886年在馬爾他島發(fā)現(xiàn)，次年證明其是布魯菌病(Brucellosis)的病原體。1985年世界衛(wèi)生組織(WHO)布魯菌病專家委員會(huì)把布魯菌屬分為6個(gè)種19個(gè)生物型，即羊種(B.melitensis生物型1～3)，牛種(B.abortus生物型1～7.9)，豬種(B.suis生物型1～5)及綿羊副睪種(B.ovis1個(gè)生物型)，沙林鼠種(B.neotomae1個(gè)生物型)，犬種(B.canis1個(gè)生物型)。進(jìn)入21世紀(jì)以來更多新的布魯菌種被發(fā)現(xiàn)，包括感染海洋哺乳動(dòng)物的鯨種布魯菌(B.ceti)和鰭腳種布魯菌(B.pinnipedialis)[1],感染田鼠和紅狐的田鼠種布魯菌(B.microti)[2]，可以感染人和樹蛙的湖浪種布魯菌(B.inopinata)[3]，以及2016年從紅狐體內(nèi)最新鑒定出的B.vulpis[4]。根據(jù)布魯菌脂多糖是否完整，可以將其分為光滑型和粗糙型兩類，其中對(duì)人致病性強(qiáng)的羊種、牛種和豬種布魯菌均為光滑型，而犬種和綿羊附睪種布魯菌為粗糙型。

布魯菌感染動(dòng)物和人類會(huì)引起布魯菌病(簡稱布病)，由羊種布魯菌、牛種布魯菌和豬種布魯菌感染引起的布魯菌病對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展和人類公共衛(wèi)生危害最為嚴(yán)重。布魯菌病在全球范圍內(nèi)流行，目前有160多個(gè)國家和地區(qū)發(fā)生過布魯菌病，我國是人間和畜間布魯菌病高發(fā)的國家之一。

布魯菌的貯存宿主很多，已知有60多種動(dòng)物(家畜、家禽、野生動(dòng)物)可以作為布魯菌貯存宿主。1931年，世界上首次報(bào)道了豬種布魯菌感染犬的病例。1966年-1967年，犬種布魯菌從犬的流產(chǎn)組織和陰道分泌物中被分離出來。1983年，我國從美國引進(jìn)的比格犬中，首次分離鑒定出犬種布魯菌[5]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人口老齡化的加劇，犬、貓等伴侶動(dòng)物飼養(yǎng)熱持續(xù)升溫。由于它們與人類的接觸密切，隨之帶來的布魯菌病等寵物相關(guān)人獸共患病，對(duì)公共衛(wèi)生安全已構(gòu)成了巨大威脅。

1 我國犬布魯菌病的流行情況

盡管對(duì)犬布魯菌病流行病學(xué)的研究較少，但由于對(duì)羊種、牛種、豬種布魯菌的易感性，可以認(rèn)為有上述布魯菌流行的國家和地區(qū)都有犬布魯菌病流行的可能。犬種布魯菌由于其對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生學(xué)的危害較低，而且常規(guī)人類布魯菌病患者并不進(jìn)行犬種布魯菌的檢測(cè)，所以其全球范圍的流行情況信息更加有限。根據(jù)中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的專家介紹，上世紀(jì)末我國從南到北，犬群普遍存在布魯菌病，南方犬布魯菌病抗體陽性率可達(dá)20%左右，北方牧區(qū)陽性率可達(dá)90%以上[6]。

在我國農(nóng)牧區(qū)省份犬布魯菌病的流行較為嚴(yán)重。有資料顯示，湖北、內(nèi)蒙古、廣西、四川、貴州等省份，犬廣泛存在布魯菌病，血清抗體陽性率介于8.16%～42.65%。2007年-2009年，薛玉平等[7]對(duì)甘肅省部分地市的150份犬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示犬布魯菌病抗體陽性率為14%；2015年，對(duì)新疆和靜縣牧區(qū)381份牧羊犬血清學(xué)樣品采用虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行初篩，結(jié)果顯示陽性率為29.65%(113/381)[8]。

在北京、上海等城市，寵物犬的布魯菌病流行情況也不容樂觀。2008年-2009年，項(xiàng)夫等[9]對(duì)北京市觀賞動(dòng)物醫(yī)院收治的犬的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示光滑型布魯菌的感染率為0.42%(5/1200),粗糙型的犬布魯菌的感染率為1.33%(16/1 200)。齊海霞等[10]對(duì)北京市部分寵物醫(yī)院的680份犬樣品進(jìn)行檢測(cè)，犬種布魯菌的抗體陽性率為1.4%，未檢測(cè)出光滑型布魯菌抗體。2012年-2013年，王寧等[11]對(duì)北京市某寵物醫(yī)院送檢的38只疑似患有布魯菌病的犬血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，22份樣品為布魯菌病血清學(xué)陽性，并且成功分離到5株犬種布魯菌。陶軍等[12]對(duì)上海市114份犬樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示，10.5%的犬感染光滑型布魯菌，未檢出粗糙型布魯菌抗體。

2 犬布魯菌病的流行病學(xué)

2.1 傳染源

犬是布魯菌的一種重要宿主，既可以感染致病性強(qiáng)的羊種、牛種和豬種布魯菌，又可以感染犬種布魯菌。被感染的雌性犬是重要的傳染源，在發(fā)生流產(chǎn)時(shí)，隨羊水、流產(chǎn)胎兒和胎盤組織一起排出大量的布魯菌，同時(shí)被感染的雌性犬的乳汁中也能夠檢測(cè)到布魯菌。在牧區(qū)，被感染的牛、羊、豬的流產(chǎn)物、胎盤、臟器也是重要的傳染源[13]。

2.2 傳播途徑

交配是犬之間布魯菌傳播的重要途徑，因?yàn)樯车婪置谖镏泻写罅康牟【?，不論是被感染的雄性犬的精液還是雌性犬的陰道分泌物都富含布魯菌[5]。含有布魯菌的流產(chǎn)物、動(dòng)物臟器和污染物等被犬舔嗅或吞食也是引起犬感染的重要途徑。除此之外，由于被感染的雌犬乳汁中含有細(xì)菌，在哺乳過程中會(huì)引起幼犬的感染。

2.3 易感動(dòng)物

幾乎所有的犬都是布魯菌的宿主，世界首例犬種布魯菌是從比格犬中分離到的[5]。項(xiàng)夫等[9]對(duì)北京市1 200只不同品種的犬進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明挪威納、哈士奇、吉娃娃、貴婦、拉布拉多、松獅、金毛、德牧、京巴等多種犬均可以感染布魯菌。在犬齡方面，3月齡～180月齡的犬都會(huì)發(fā)生感染。

3 犬感染布魯菌病的主要臨床癥狀

犬感染布魯菌病后，部分犬盡管出現(xiàn)血清學(xué)陽性，但并不出現(xiàn)臨床癥狀。James D R等[14]報(bào)道了澳大利亞的豬種布魯菌流行地區(qū)，約40%的血清學(xué)陽性犬不表現(xiàn)出臨床癥狀。

生殖系統(tǒng)相關(guān)病變是犬布魯菌病的主要臨床癥狀，雌性犬通常在懷孕晚期發(fā)生流產(chǎn)，流產(chǎn)后4周～6周在陰道分泌物和子宮內(nèi)容物中仍可以檢測(cè)到大量的布魯菌，感染的雌性犬的乳汁也含有大量布魯菌。雄性犬的附睪和前列腺是布魯菌寄生和繁殖的靶器官，布魯菌感染引起的附睪炎和前列腺炎能引起雄性犬不育。在感染后的前2周可以從犬精液中檢測(cè)到大量的布魯菌。

除此之外，發(fā)病犬還可能出現(xiàn)眼炎、椎骨椎間盤炎、淋巴結(jié)腫大、脾臟腫大、跛行、背痛、關(guān)節(jié)疼痛等非生殖系統(tǒng)癥狀[5,14]。

4 犬布魯菌病的診斷方法

犬布魯菌病是引起犬流產(chǎn)的主要原因，因此雌性犬出現(xiàn)流產(chǎn)或雄性犬出現(xiàn)繁殖機(jī)能障礙時(shí)應(yīng)該考慮對(duì)其進(jìn)行布魯菌病的診斷。非生殖系統(tǒng)的臨床癥狀不宜作為犬布魯菌病診斷的依據(jù)，流行病學(xué)和病理學(xué)只能作為診斷的參考依據(jù)[5]。細(xì)菌分離培養(yǎng)是診斷犬布魯菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于分離率較低和生物安全因素，血清學(xué)診斷方法在犬布魯菌病的檢測(cè)中應(yīng)用更加廣泛。

4.1 病原學(xué)診斷方法

4.1.1 病原的分離培養(yǎng) 犬感染布魯菌后2周～4周便出現(xiàn)菌血癥，可采集犬的抗凝血樣本進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。為了提高分離率可以使用雙相增菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d無布魯菌生長視為陰性。雌性犬的流產(chǎn)胎兒、胎盤、陰道分泌物也是適于細(xì)菌分離的病料，這些病料一般易被雜菌污染，通常需要使用選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，培養(yǎng)2周后仍無布魯菌生長視為陰性[11]。自然光下垂直觀察，布魯菌菌落略灰白，凸起；側(cè)光觀察，呈現(xiàn)灰白的蜂蜜色。顯微鏡觀察，可見牛種、羊種、豬種菌落邊緣整齊、光滑，而犬種有顆粒狀物質(zhì)，為粗糙型。典型的布魯菌菌落形態(tài)和菌落的形成時(shí)間對(duì)鑒定布魯菌有重要意義。

4.1.2 病原的鏡檢 分離到細(xì)菌后可以采用經(jīng)典的柯茲洛夫斯基染色法進(jìn)行鏡檢觀察，布魯菌呈紅色球桿狀，其他細(xì)菌呈綠色或藍(lán)色。通過結(jié)晶紫染色法和吖啶黃凝集試驗(yàn)確定分離到的布魯菌為光滑型布魯菌還是粗糙型犬種布魯菌，犬種布魯菌的菌落會(huì)被結(jié)晶紫染成紫色，并且與吖啶黃發(fā)生凝集反應(yīng)。

4.1.3 病原的生化試驗(yàn) 傳統(tǒng)的種型鑒定方法仍是目前最基礎(chǔ)、最經(jīng)典的方法，根據(jù)不同種型布魯菌對(duì)CO2的需求、H2S生成、脲酶分解速率、染料抵抗力、單因子血清凝集性和噬菌體裂解能力等差異對(duì)布魯菌進(jìn)行分類，可感染犬的羊種、牛種、豬種和犬種布魯菌的生化反應(yīng)特性見表1。

表1 不同種型布魯菌生化反應(yīng)特性[15]

4.1.4 病原的分子生物學(xué)檢測(cè) 在常規(guī)PCR檢測(cè)方法中，根據(jù)bcsp31基因設(shè)計(jì)引物B4/B5，擴(kuò)增長度為223 bp的片段，該引物一直沿用至今，在人血液標(biāo)本中檢測(cè)布魯菌的靈敏度最高[16]。B4/B5引物只可以確定細(xì)菌是否為布魯菌，進(jìn)一步確定種型需要結(jié)合生化試驗(yàn)或者采用多重PCR方法。

AMOS PCR是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的一種布魯菌分型的多重PCR方法，可以通過一個(gè)PCR反應(yīng)對(duì)羊種、牛種、豬種和綿羊附睪種布魯菌進(jìn)行區(qū)分。Bruce-ladder PCR也是OIE推薦的一種布魯菌分型的多重PCR方法，在一個(gè)反應(yīng)體系同時(shí)添加16條引物，可以一次性區(qū)分羊種、牛種、豬種和犬種布魯菌。

4.2 血清學(xué)診斷方法

4.2.1 光滑型布魯菌抗體的檢測(cè) 根據(jù)《動(dòng)物布魯菌病診斷技術(shù)》(GB/T 18646-2002)，虎紅平板凝集試驗(yàn)適用于犬感染光滑型的羊種、牛種、豬種布魯菌的初篩，試管凝集試驗(yàn)用于感染上述光滑型菌株的確診。試管凝集試驗(yàn)判定犬血清1∶50稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為陽性，1∶25稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時(shí)，受檢血清判定為可疑。除此之外，商品化膠體金試紙條由于靈敏度高、操作簡單在臨床診斷方面得到了廣泛的應(yīng)用。

4.2.2 犬種布魯菌抗體的檢測(cè) 檢測(cè)犬種布魯菌需要采用粗糙型布魯菌菌體制備的粗糙型虎紅平板凝集抗原和粗糙型試管凝集抗原進(jìn)行檢測(cè)。Cortina M E等[17]用犬種布魯菌的粗糙型脂多糖和外膜蛋白的混合抗原建立了檢測(cè)犬種布魯菌抗體的間接ELISA方法和膠體金免疫層析方法，具有極高的靈敏性和特異性。目前，國內(nèi)商品化的檢測(cè)粗糙型布魯菌抗體的膠體金試紙條比較少見。

5 犬布魯菌病的治療

目前尚無理想的犬布魯菌病治療方案。由于只有人患布魯菌病后才采取治療措施，動(dòng)物被感染后一般直接撲殺，所以犬布魯菌病治療的相關(guān)研究很少。王興龍等[5]報(bào)道四環(huán)素類抗生素與鏈霉素聯(lián)合使用對(duì)犬布魯菌病的治療有一定的效果。James D R等[14]采用多西環(huán)素和利福平聯(lián)合用藥，結(jié)合外科手術(shù)修復(fù)病變器官的治療方案，在治療犬感染豬種布魯菌的病例中取得了較好的治療效果。值得注意的是對(duì)感染布魯菌病的犬開展外科手術(shù)時(shí)有可能造成人員的暴露，所以應(yīng)先給動(dòng)物使用抗生素進(jìn)行治療，降低動(dòng)物體內(nèi)細(xì)菌數(shù)量后再開展外科手術(shù)，同時(shí)手術(shù)時(shí)操作人員仍應(yīng)采取適當(dāng)?shù)纳锇踩雷o(hù)。除此之外，由于利福平具有肝毒性，長期使用抗生素治療應(yīng)定期監(jiān)測(cè)動(dòng)物的肝臟指標(biāo)。

6 展望

犬作為一種布魯菌的宿主，可以將羊種、牛種、豬種和犬種布魯菌傳播給人[14]。犬不論是否發(fā)病，攜帶犬種布魯菌的犬有可能通過口鼻接觸、職業(yè)性接觸(如寵物醫(yī)生、實(shí)驗(yàn)室人員)等途徑將病原向人類傳播。當(dāng)人類感染犬種布魯菌時(shí)，通常呈現(xiàn)出輕微的或無典型的臨床癥狀，表現(xiàn)出頭痛、回歸熱、虛弱、乏力、出汗、體重減輕等癥狀[18]?；加忻庖呷毕莶〉膫€(gè)體更容易感染布魯菌，如癌癥病人、艾滋病患者以及接受移植的患者，兒童、孕婦等都容易感染布魯菌病[5]。

目前，已有多篇人感染犬種布魯菌的相關(guān)報(bào)道[19-21]，而犬傳播羊種、牛種和豬種布魯菌的報(bào)道較罕見，主要原因是在羊種、牛種和豬種布魯菌流行地區(qū)，患病家畜是更主要的傳染源，犬的傳播作用常常被忽視[22]。然而，隨著寵物飼養(yǎng)的不斷增加，隨之帶來了經(jīng)寵物傳播布魯菌病的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是從北京、上海等城市的犬中檢測(cè)到致病性強(qiáng)的光滑型布魯菌的抗體，患病寵物已對(duì)城市地區(qū)的公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了巨大威脅。加大寵物布魯菌病防治的宣傳工作，加強(qiáng)犬只管理，開展犬布魯菌病監(jiān)測(cè)已經(jīng)迫在眉睫。除此之外，由于犬可感染的布魯菌種類較多，檢測(cè)手段也相對(duì)落后，而且還沒有犬用布魯菌病疫苗，所以在犬用診斷試劑和疫苗研發(fā)方面仍然需要加大投入。