宋月娟，馮強(qiáng)生，哈小琴

(中國人民解放軍蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院檢驗(yàn)科，蘭州 730050)

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)的早期表現(xiàn)不典型，治療周期長，盡管積極抗結(jié)核治療，但病死率仍高達(dá)19.0%～28.9%[1]，早期準(zhǔn)確的診斷是治療的關(guān)鍵。目前尚缺乏理想的早期診斷結(jié)核性腦膜炎的實(shí)驗(yàn)方法，腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)涂片抗酸染色敏感度往往<20%，腦脊液培養(yǎng)敏感度為25%～70%，在發(fā)展中國家僅為10%，且需要等待數(shù)周才能得到結(jié)果[2]。而采用PCR法檢測腦脊液中結(jié)核分枝桿菌DNA，由于其假陽性較多，實(shí)驗(yàn)條件要求較高，故難以在結(jié)核性腦膜炎多發(fā)的欠發(fā)達(dá)地區(qū)普及和推廣。結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)廣泛用于結(jié)核病的診斷，但T-SPOT腦脊液檢測在結(jié)核性腦膜炎中的診斷價值鮮見文獻(xiàn)報道。本文回顧性分析我院82例結(jié)核性腦膜炎腦脊液T-SPOT檢測的患者資料，分析腦脊液標(biāo)本結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT)檢測、CSF生化和血清降鈣素原(PCT)的變化，為結(jié)核性腦膜炎患者的早期診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 對本院221份腦脊液標(biāo)本進(jìn)行篩查，統(tǒng)計腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)大于100×106/L或者高度懷疑腦膜炎患者淋巴細(xì)胞計數(shù)大于50×106/L的82例腦脊液標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，查閱臨床病例資料，根據(jù)患者臨床診斷，統(tǒng)計結(jié)核性腦膜炎實(shí)驗(yàn)組和對照組患者腦脊液蛋白、腦脊液葡萄糖、腦脊液氯離子、腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)和患者血清PCT等指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線分析。

1.2 儀器與試劑 T-SPOT TB試劑盒購自英國Oxford公司。離心機(jī)購自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 腦脊液結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)操作步驟：取腦脊液4 ml以上，放入15 ml離心管中(加AIM-V至3 ml)，700 g離心7 min；倒掉上清，混勻細(xì)胞沉淀后再加入AIM-V培養(yǎng)液至3 ml，700 g離心7 min；倒掉上清，加入500 μl AIM-V培養(yǎng)液，震蕩混勻；取80 μl細(xì)胞懸液至細(xì)胞計數(shù)儀或顯微鏡計數(shù)細(xì)胞，按順序加入陰性對照(AIM-V)、抗原A，抗原B，陽性對照，各50 μl，每孔加100 μl配置好的細(xì)胞液(2.5×105/孔)；標(biāo)注時間，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～20 h，次日準(zhǔn)備PBS液，根據(jù)標(biāo)本量計算酶標(biāo)二抗所需的量，以1∶200的比例將酶標(biāo)二抗原液與PBS液混合(混合一定要充分均勻)，制成二抗工作液；將過夜培養(yǎng)的96孔板中培養(yǎng)液倒掉，每孔加入200 μl PBS液洗板4遍后拍干板孔，每孔加50 μl二抗工作液4～8℃孵育1 h；將酶標(biāo)二抗液體倒掉，每孔用PBS液洗滌4遍，拍干后加顯色液各50 μl，避光靜置5～10min(陽性孔出現(xiàn)密布的斑點(diǎn))，用蒸餾水洗滌終止反應(yīng)；將板孔內(nèi)液體拍干，晾至底膜干透可以4×物鏡顯微鏡檢斑點(diǎn)數(shù)或上機(jī)讀取并記錄報告結(jié)果。

1.3.2 檢測原理：腦脊液分離單個核細(xì)胞；結(jié)核特異性抗原(ESAT-6/CFP10)與腦脊液單個核細(xì)胞孵育，結(jié)核致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞分泌γ-干擾素“雙抗夾心法”檢測釋放的γ-干擾素，從而檢測結(jié)核致敏的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞是否存在，從而判斷患者是否存在結(jié)核分枝桿菌感染(包括潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染與活動性結(jié)核分枝桿菌感染)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 軟件應(yīng)用spass17.0，非計量數(shù)據(jù)用卡方檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用ROC曲線。

2 結(jié)果

2.1 82例腦脊液標(biāo)本結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)檢測結(jié)果 腦脊液T-SPOT試驗(yàn)檢測在結(jié)核性腦膜炎患者中的陽性率為64.63%(53/82)，敏感度為98.11%，特異度為100%，其中結(jié)核性腦膜炎患者年齡中位數(shù)為30.08歲，男/女為2.71。非結(jié)核性腦膜炎29例患者中，病毒性腦膜炎8例，細(xì)菌性腦膜炎5例，疑似結(jié)核性腦膜炎3例，炎性脫髓鞘性疾病1例，非腦炎11例，假陽性1例。

2.2 結(jié)核性腦膜炎患者和非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液生化和血清感染指標(biāo)ROC曲線分析 ROC曲線下面積(AUC)大小分別為腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)0.996，腦脊液蛋白0.965，PCT 0.392，腦脊液葡萄糖0.109和腦脊液氯離子0.061，所以腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)和腦脊液蛋白具有較高的敏感度和特異度，且結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)和腦脊液蛋白的均值分別為323.88±198.76個/L，1 478.2±778.64 mg/L。

圖1 結(jié)核性腦膜炎患者和非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液生化和血清PCT ROC曲線分析

3 討論

結(jié)核斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(T-SPOT)作為一種新的酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)，為結(jié)核病的早期診斷提供了新的方法。它是利用結(jié)核分枝桿菌感染患者淋巴細(xì)胞中存在結(jié)核特異的活化T淋巴細(xì)胞，這些淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核分枝桿菌特異抗原ESAT- 6或CFP-10刺激，分泌γ干擾素，γ干擾素是結(jié)核分枝桿菌感染后機(jī)體免疫應(yīng)答中最重要的細(xì)胞因子，具有抗感染、抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用，在機(jī)體抗感染與免疫中發(fā)揮重要作用[3，4]。據(jù)國外文獻(xiàn)報道，結(jié)核斑點(diǎn)試驗(yàn)診斷結(jié)核性腦膜炎的敏感度為83%～97%，特異度高達(dá)100%[5]?；仡櫺苑治鑫以?2例疑似結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液T-SPOT檢測結(jié)果、腦脊液生化指標(biāo)和血清感染指標(biāo)PCT的變化，表明T-SPOT檢測在結(jié)核性腦膜炎患者具有較高的陽性率為64.63%(53/82)，敏感度為98.11%，特異度為100%，敏感度和特異度均高于陳永芳等[6]研究的外周血T-SPOT.TB檢測結(jié)核性腦膜炎敏感度67.5%和張秀英等[7]

T-SPOT.TB法檢測腦脊液單個核細(xì)胞對結(jié)核性腦膜炎檢測敏感度93.33%，特異度96.67%。結(jié)核性腦膜炎患者和非結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液生化和血清感染指標(biāo)PCT ROC曲線分析曲線下面積(AUC)大小分別為腦脊液白細(xì)胞數(shù)0.996，腦脊液蛋白0.965，PCT 0.392，腦脊液葡萄糖0.109和腦脊液氯離子0.061，表明腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)和腦脊液蛋白測定價值優(yōu)于血清PCT，腦脊液葡萄糖和腦脊液氯離子的測定。數(shù)據(jù)顯示結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液淋巴細(xì)胞計數(shù)和腦脊液蛋白的均值分別為323.88±198.76個/L，1 478.2±778.64 mg/L。但腦脊液蛋白含量受年齡的影響以及淋巴細(xì)胞計數(shù)受創(chuàng)傷和蛛網(wǎng)膜下腔出血等因素影響[8]，應(yīng)注意排除其他因素的干擾。

本實(shí)驗(yàn)檢測方法檢驗(yàn)時間短，24 h內(nèi)可以回報臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而且標(biāo)本陰陽性結(jié)果觀測直觀，易于保存，并且陽性率、敏感度和特異度高，對實(shí)驗(yàn)條件要求較低，與臨床同類實(shí)驗(yàn)XpertMTB/RIF對結(jié)核性腦膜炎的臨床診斷價值比較有待近一步的驗(yàn)證[9]。本實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)為患者腦脊液標(biāo)本要求大于5 ml，需進(jìn)行腦脊液淋巴細(xì)胞數(shù)計數(shù)篩查合格標(biāo)本，而且標(biāo)本放置時間不宜過長，需要及時處理。

總之，腦脊液T-SPOT.TB檢測是診斷結(jié)核性腦膜炎的一種較為快速、經(jīng)濟(jì)、敏感度和特異度高的一種方法，可用于結(jié)核性腦膜炎的早期快速診斷。