王冬梅 劉 瑤 王興通

(泰山醫(yī)學(xué)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與康復(fù)學(xué)院，山東 泰安 271016)

糖尿病是一種全身代謝性疾病，發(fā)病率逐年上升，引起全世界的高度重視[1]，尤其是II型糖尿病，它會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生一系列慢性并發(fā)癥，使患者致殘或致死[2]。海馬組織對(duì)血糖的變化很敏感，糖尿病腦萎縮的主要變化發(fā)生在海馬組織[3]。神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)依賴(lài)線(xiàn)粒體提供能量，線(xiàn)粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗，對(duì)線(xiàn)粒體靶點(diǎn)研究可以為糖尿病發(fā)病機(jī)理及防治提供重要的參考價(jià)值。隨著全民健身及崇尚自然熱潮的興起，運(yùn)動(dòng)及天然保健食品在糖尿病中的作用越來(lái)越受到人們的重視。四葉參的塊根中富含多糖、生物堿和黃酮等成分，具有清除自由基及抗氧化作用[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀(guān)察運(yùn)動(dòng)和四葉參干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠血糖、海馬線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔、鈣轉(zhuǎn)運(yùn)及Bcl-2/Bax的影響，闡明其改善糖尿病的海馬線(xiàn)粒體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康雄性Wistar大鼠50只，體重(166±8)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，分籠飼養(yǎng)，自由飲水?dāng)z食。動(dòng)物房?jī)?nèi)溫度(23±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，自然光照交替。

1.2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素和偶氮砷為Sigma公司產(chǎn)品，泰山四葉參購(gòu)自泰山四大名藥開(kāi)發(fā)有限公司，血糖試紙為德國(guó)羅氏，Bcl-2和Bax抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自博士德公司，線(xiàn)粒體提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，其它為國(guó)產(chǎn)分析純。紫外分光光度計(jì)產(chǎn)自上海分析儀器總廠(chǎng)，雙光束紫外分光光度計(jì)為天美科技有限公司儀器。配制MPTP測(cè)試介質(zhì)：230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖和3 mmol/L Hepes(pH7.4)。

1.3 糖尿病模型制備及分組

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，高糖高脂喂養(yǎng)4 w，30 mg/kg一次性注射鏈脲佐菌素建立實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型。造模成功后分為糖尿病對(duì)照組(DM組)、糖尿病運(yùn)動(dòng)組(DMT組)、糖尿病中藥組(DML組)、糖尿病運(yùn)動(dòng)和中藥組(DMTL組)，每組6只大鼠，另取6只大鼠作為正常對(duì)照組(C組)。

1.4 運(yùn)動(dòng)與中藥干預(yù)方法

采用跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，15 m/min，坡度5°，隔日運(yùn)動(dòng)，每次60 min，持續(xù)8 w。中藥干預(yù)組大鼠每日灌胃四葉參多糖200 mg/kg，其余組大鼠灌服同體積的生理鹽水，持續(xù)8 w。

1.5 線(xiàn)粒體提取

10%水合氯醛400 mg/kg麻醉大鼠，斷頭分離海馬，剪碎，500 μl裂解液勻漿，加入1.5 ml裂解液，1000 r/min離心10 min，取沉淀。加入1.5 ml分離液，1000 r/min離心10 min，取上清。6000 r/min離心10 min，棄上清，加入1 ml線(xiàn)粒體保存介質(zhì)，6000 r/min離心20 min，獲得的沉淀即為線(xiàn)粒體。采用BCA法測(cè)定線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)。

1.6 MPTP開(kāi)放檢測(cè)

根據(jù)蛋白定量結(jié)果，移取一定量的線(xiàn)粒體到比色皿，MPTP測(cè)試介質(zhì)補(bǔ)足到3 ml，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)520 nm處的吸光度值[5]。

1.7 線(xiàn)粒體Ca2+ 轉(zhuǎn)運(yùn)檢測(cè)

在EP管中加入3 ml MPTP測(cè)試介質(zhì)和一定量的線(xiàn)粒體，50 μmol/L AIII作為Ca2+指示劑，室溫避光染色45 min，雙光束紫外分光光度計(jì)檢測(cè)675～685 nm處的吸光值[6]。

1.8 Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)

每20 mg海馬組織碎片加入0.2 ml裂解液，4℃ 12000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法測(cè)定蛋白含量。濃縮膠80V 20 min，分離膠120V 60 min。將蛋白分子轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入Bcl-2/Bax一抗，4℃過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血糖水平的檢測(cè)結(jié)果

由表1和圖1可知，與C組大鼠相比，DM組大鼠的血糖水平顯著升高(P﹤0.01)；與DM組相比，DMT組和DMTL組大鼠的血糖水平顯著降低(P﹤0.01)，DML組血糖無(wú)顯著性變化(P﹥0.05)。

表1 各組大鼠血糖水平比較

注：與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，##P<0.01。

與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，##P<0.01

2.2 MPTP開(kāi)放及線(xiàn)粒體Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)的檢測(cè)結(jié)果

與C組相比，DM組大鼠線(xiàn)粒體吸光度值顯著減小(P﹤0.01)，表明MPTP的開(kāi)放程度顯著增加，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯增大(P﹤0.01)；與DM組相比，DMT及DMTL組大鼠線(xiàn)粒體的吸光度值顯著增大(P﹤0.05)，表明MPTP的開(kāi)放程度顯著減小，Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)量明顯減小(P﹤0.05)。DML與DM組無(wú)顯著性差異(P﹥0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠線(xiàn)粒體吸光度值及Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)量比較

注：與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，#P<0.05。

2.3 Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

與C組比較，DM組大鼠海馬Bax蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P﹤0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P﹤0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著減小(P﹤0.01)；與DM組相比，DMT組Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P﹤0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P﹤0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著增大(P﹤0.01)；DMTL組與DM組相比，Bax蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P﹤0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P﹤0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著增大(P﹤0.01)；DML組與DM組相比Bcl-2/Bax比值增大(P﹤0.05)，但兩蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P﹥0.05)。見(jiàn)表3和圖2～4。

表3 各組大鼠海馬Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)比較

注：與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，#P<0.05，##P<0.01。

圖2 免疫印跡結(jié)果

圖3 Bcl-2和Bax灰度值

與C組比較，**P<0.01；與DM組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖4 Bcl-2和Bax灰度值的比值

3 討 論

研究表明，高血糖容易引起海馬神經(jīng)元凋亡[3]，線(xiàn)粒體功能障礙和鈣穩(wěn)態(tài)的改變與細(xì)胞凋亡及糖尿病的發(fā)病有密切關(guān)系[7]。本研究試圖尋求糖尿病發(fā)生的中樞機(jī)制及新的藥物作用靶點(diǎn)，從調(diào)節(jié)生活方式的角度積極尋求改善糖尿病的有效方法。

線(xiàn)粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPTP)是一種多蛋白復(fù)合體，位于線(xiàn)粒體內(nèi)外膜交界處，介導(dǎo)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，其高水平開(kāi)放在細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)過(guò)程中起著決定性作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠海馬MPTP開(kāi)放程度顯著增大，表明MPTP的開(kāi)放可能是糖尿病發(fā)病的機(jī)制之一。運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)與四葉參相結(jié)合的方法均能降低MPTP的開(kāi)放，降低血糖水平，提示運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)與中藥組聯(lián)合能夠改善糖尿病癥狀，此功能與其降低MPTP的開(kāi)放相關(guān)。實(shí)驗(yàn)也表明，單純8周的四葉參干預(yù)有改善MPTP開(kāi)放和血糖水平的傾向，但沒(méi)有顯著性變化，推測(cè)可能8周四葉參干預(yù)的時(shí)間并不足以引起顯著性變化，飲食干預(yù)或許需要長(zhǎng)期堅(jiān)持才能取得明顯效果。

Bcl-2家族蛋白對(duì)MPTP的開(kāi)放程度起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。促凋亡蛋白Bax介導(dǎo)MPTP的開(kāi)放，而抑凋亡蛋白Bcl-2則通過(guò)抑制MPTP的開(kāi)放，發(fā)揮抑凋亡的作用[9]，細(xì)胞凋亡取決于Bcl-2/Bax比值。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)；運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)與四葉參聯(lián)合干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，Bax表達(dá)下調(diào)，表明運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)與中藥干預(yù)降低血糖的作用機(jī)制可能和Bcl-2/Bax調(diào)節(jié)MPTP的開(kāi)放有關(guān)。

線(xiàn)粒體是細(xì)胞內(nèi)Ca2+調(diào)節(jié)的重要細(xì)胞器，線(xiàn)粒體內(nèi)Ca2+聚積可導(dǎo)致MPTP長(zhǎng)時(shí)間開(kāi)放，從而又會(huì)介導(dǎo)線(xiàn)粒體的Ca2+釋放，細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡能啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。本研究中，吸光值下降表明測(cè)試系統(tǒng)內(nèi)的Ca2+濃度降低，線(xiàn)粒體攝取Ca2+；吸光值上升表明測(cè)試系統(tǒng)內(nèi)Ca2+濃度升高，線(xiàn)粒體外排Ca2+。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠海馬組織線(xiàn)粒體Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著增加，而運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)充四葉參能夠降低Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)量，表明運(yùn)動(dòng)及運(yùn)動(dòng)聯(lián)合飲食干預(yù)降血糖的機(jī)制與MPTP開(kāi)放及Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，提示降低MPTP的大量開(kāi)放，減少Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)糖尿病的改善有重要意義。

綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)或運(yùn)動(dòng)與飲食干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠血糖的改善有顯著效果，其可能機(jī)制與細(xì)胞Bcl-2/Bax升高所致MPTP開(kāi)放下調(diào)及Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)降低有密切的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)為糖尿病的防治提供了一定的理論基礎(chǔ)，需要深入加以研究。