孔 琦 黃 強(qiáng) 陳 斌王道明朱家勝夏亞斌

(1.皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院胃腸一科，安徽 蕪湖 241000； 2.安徽省立醫(yī)院普外科，安徽 合肥 230032)

機(jī)體的免疫狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，正常機(jī)體的Th1/Th2型細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡，對維持機(jī)體正常的免疫功能至關(guān)重要，當(dāng)Th1/Th2平衡失調(diào)并向Th1或Th2轉(zhuǎn)化時(shí)，稱為Th1/Th2的偏移[1]。研究表明Th1/Th2偏移與腫瘤、自身免疫性疾病、微生物感染、移植排斥反應(yīng)等多種疾病有關(guān)[2-4]，Th1/Th2偏移與惡性腫瘤的關(guān)系已成為當(dāng)前人們研究的一個(gè)熱點(diǎn)，我們以白介素(IL)-2、干擾素(IFN)-γ代表Th1型細(xì)胞因子，以IL-4、IL-6代表Th2型細(xì)胞因子，觀察選擇性環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)抑制劑尼美舒利對人膽管癌細(xì)胞Th1/Th2偏移的逆轉(zhuǎn)作用，探討其抗腫瘤的免疫學(xué)機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司(美國)，MTT為Sigma公司(美國)產(chǎn)品，IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-6 ELISA試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗IFN-γ和PE標(biāo)記的抗IL-4單抗分別購自Biolegend公司。尼美舒利購自Sigma公司(美國)，相對分子量為308.3。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及藥物準(zhǔn)備 人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系HCCC-9810接種于含10%小牛血清、1×10 U/L青霉素、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取308.3 mg尼美舒利溶于1 ml的DMSO中，加入9 ml的培養(yǎng)液配成100 mmol/L的母液，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋，配成不同濃度的尼美舒利，使其終濃度分別為25、50、100、200 μmol/L。取對數(shù)生長期膽管癌細(xì)胞,用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 ml，置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的尼美舒利，對照組不加藥，檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT比色法) 以每孔1×104個(gè)細(xì)胞將對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別加入不同濃度尼美舒利，每組4個(gè)復(fù)孔,設(shè)陰性對照組，于48 h、72 h、96 h后傾去培養(yǎng)液，用MTT法檢測細(xì)胞吸光度，空白對照調(diào)零并計(jì)算抑制率。抑制率(IR)=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3尼美舒利作用后的透射電鏡觀察 將尼美舒利作用后的細(xì)胞置于EP管中，2000 r/min離心5～10 min后棄上清，固定后梯度酒精脫水，用環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片后染色，在透射電子顯微鏡上觀察細(xì)胞形態(tài)變化，記錄結(jié)果并照相。

1.2.4細(xì)胞因子測定 取對數(shù)生長期膽管癌細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔2 ml，置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的尼美舒利，對照組不加藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，72 h后分別吸取上清液，用ELISA法分別檢測IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ表達(dá)水平。

1.2.5Th1、Th2亞群流式細(xì)胞儀檢測 收集不同濃度尼美舒利處理48 h的HCCC-9810細(xì)胞，離心后棄上清；細(xì)胞用PBS緩沖液洗漂洗，加入固定液0.5 ml固定20 min，1500 r/min離心5 min，棄上清。加入2 ml穿透液，室溫暗處10 min，1000 r/min離心5 min，加入FITC標(biāo)記的抗IFN-γ和PE標(biāo)記的抗IL-4單抗，避光孵育30 min，2 ml穿透液漂洗1次，0.5 ml多聚甲醛懸浮細(xì)胞后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測IFN-γ和IL-4水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 尼美舒利對HCCC-9810細(xì)胞的抑制作用

MTT結(jié)果顯示尼美舒利呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性抑制人膽管癌HCCC-9810細(xì)胞的生長，隨藥物濃度增加、作用時(shí)間延長，細(xì)胞生長抑制率逐步增加，見圖1。

圖1 尼美舒利對膽管癌細(xì)胞生長的抑制作用

2.2 尼美舒利作用后的透射電鏡觀察

正常生長的HCCC-9810細(xì)胞透射電鏡下細(xì)胞器豐富，細(xì)胞表面覆有大量絨毛(圖2A)，尼美舒利作用后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞表面微絨毛減少，切片中出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，新月體形成等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變(圖2B)。

A：正常生長的HCCC-9810細(xì)胞；B：尼美舒利作用后的細(xì)胞

2.3 ELISA法檢測尼美舒利對膽管癌細(xì)胞因子表達(dá)的影響

加入不同濃度的尼美舒利作用于膽管癌細(xì)胞后，實(shí)驗(yàn)組中IL-2、IFN-γ濃度呈現(xiàn)上升趨勢，而IL-4、IL-6濃度下降，且隨濃度上升作用明顯，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 ELISA法檢測尼美舒利對膽管癌細(xì)胞因子表達(dá)的影響

注：與對照組相比，*P<0.05。

2.4 尼美舒利對HCCC-9810細(xì)胞Th1/Th2的影響

流式細(xì)胞儀顯示隨尼美舒利濃度升高，實(shí)驗(yàn)組Th1細(xì)胞陽性率升高，而Th2細(xì)胞呈下降趨勢，Th1/Th2比值升高(P<0.05)，見表2，圖3。

表2 尼美舒利對膽管癌細(xì)胞Th1/Th2的影響

3 討 論

隨著腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展，人們認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與荷瘤機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。正常的機(jī)體免疫系統(tǒng)，對體內(nèi)腫瘤細(xì)胞有識別與清除作用，當(dāng)機(jī)體免疫功能受抑制時(shí)，腫瘤細(xì)胞能以多種方式逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，得以存活并進(jìn)一步發(fā)展，而新生腫瘤又能夠分泌多種因子反過來加重對機(jī)體的免疫抑制。近年來研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織多分泌Th2類細(xì)胞因子，處于Th2細(xì)胞因子優(yōu)勢狀態(tài)，這可能是腫瘤發(fā)生免疫逃逸的機(jī)理之一，因此研究Thl/Th2細(xì)胞狀態(tài)，從而為腫瘤免疫治療提供依據(jù)，已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)。

Yamamura等[5]首先報(bào)道腫瘤患者呈Th2類細(xì)胞因子優(yōu)勢表達(dá)，處于Th1/Th2偏移狀態(tài), 這種偏移可能是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生免疫逃逸持續(xù)增長的機(jī)制。Li等[6]采用ELISA法檢測了124例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者和124例健康體檢個(gè)體外周血術(shù)前術(shù)后Th1和Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者術(shù)前IL-4和IL-10濃度明顯升高，而IL-2和IFN-γ濃度顯著降低。同術(shù)前相比，手術(shù)后患者IL-4和IL-10濃度顯著降低，而IL-2和IFN-γ濃度明顯升高。術(shù)后IL-4水平異常的患者1年及3年累積復(fù)發(fā)率明顯高于正常患者，且中位生存時(shí)間和生存率顯著降低。近年來流行病學(xué)研究顯示長期口服非甾體抗炎藥可減少大腸癌的發(fā)生，大多數(shù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞培養(yǎng)研究也顯示其能抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長增殖，其機(jī)制目前多認(rèn)為與其抑制環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達(dá)有關(guān)。此外國內(nèi)外研究還發(fā)現(xiàn), COX-2通過催化花生四烯酸使其代謝產(chǎn)物PGE2增加，進(jìn)一步通過EP2受體抑制樹突狀細(xì)胞的分化和功能,通過Th1/Th2偏移減弱細(xì)胞免疫所調(diào)節(jié)的抗腫瘤反應(yīng)[7-8]，這為膽管癌的防治提供了新的分子靶點(diǎn)。尼美舒利是一種新型COX-2抑制劑，對多種腫瘤的生長具有抑制作用，我們前期試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)[9-10]，選擇性COX-2抑制劑尼美舒利對體外培養(yǎng)膽管癌細(xì)胞QBC939的增殖具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。為繼續(xù)探討COX-2抑制劑抗腫瘤機(jī)制，本研究繼續(xù)采用選擇性COX-2抑制劑尼美舒利作用于膽管癌細(xì)胞，觀察其對膽管癌細(xì)胞株Th1/Th2平衡的影響。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尼美舒利抑制人膽管癌HCCC-9810細(xì)胞生長，呈明顯的濃度和時(shí)間依賴性，并且隨藥物濃度增加、作用時(shí)間延長，細(xì)胞生長抑制率逐步增加，透射電鏡下尼美舒利作用后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞表面微絨毛減少，切片中出現(xiàn)細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，新月體形成等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。我們采用ELISA法和流式細(xì)胞儀檢測不同濃度尼美舒利作用于膽管癌細(xì)胞后Th1/Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，以進(jìn)一步探討其抑制腫瘤生長的免疫機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，隨藥物濃度增加，實(shí)驗(yàn)組中IL-2、IFN-γ濃度呈現(xiàn)上升趨勢，而IL-4、IL-6濃度下降， Th1/Th2比例升高，這種作用在低濃度水平時(shí)就開始出現(xiàn)，并隨著藥物濃度升高而增強(qiáng)，表現(xiàn)為明顯的逆轉(zhuǎn)作用，這提示我們尼美舒利可能是通過誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞表達(dá)Th1細(xì)胞而抑制Th2細(xì)胞的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)Th1/Th2偏移，抑制腫瘤生長。

圖3 尼美舒利對HCCC-9810細(xì)胞Th1/Th2影響的典型流式圖

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明膽管癌細(xì)胞Th2優(yōu)勢表達(dá)可能是腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制之一，這提示我們可以通過調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的免疫治療。