姜寧 張峰 郭魯閩 張秀榮

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分引發(fā)的慢性氣道炎癥性疾病，容易引起氣道上皮細(xì)胞的壞死脫落、纖毛受損，同時(shí)平滑肌細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、黏膜下腺體增生會(huì)引起氣道基底膜的增厚及氣道黏液分泌過(guò)多等病理表現(xiàn)。目前認(rèn)為哮喘的主要發(fā)病機(jī)制是TH1/TH2炎癥細(xì)胞因子比例失衡導(dǎo)致的[1]，使TH2細(xì)胞數(shù)目的相對(duì)增多和功能的亢進(jìn)優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。內(nèi)外源性過(guò)敏源誘發(fā)機(jī)體過(guò)敏反應(yīng)，激活CD4+TH2細(xì)胞，而CD4+TH2細(xì)胞為主的T細(xì)胞受刺激之后活性增強(qiáng)，進(jìn)而釋放白細(xì)胞介素-4(interleukin-4, IL-4)、IL-5為主的TH2型炎癥因子[2]。并且反過(guò)來(lái)會(huì)抑制CD4+TH1細(xì)胞釋放干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)等細(xì)胞因子，導(dǎo)致TH1/TH2細(xì)胞比例失衡。目前糖皮質(zhì)激素雖然是治療哮喘急性發(fā)作最有效的藥物，但也存在諸多不良反應(yīng)。中醫(yī)中藥對(duì)調(diào)節(jié)TH1/TH2失衡狀態(tài)有一定作用，可緩解哮喘癥狀。白藜蘆醇(resveratrol)是一種多酚類(lèi)化合物，在自然界中普遍存在，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化應(yīng)激等多種藥理活性[3-5]。為探究白藜蘆醇對(duì)哮喘小鼠肺功能及氣道炎癥的影響，本研究以卵蛋白致敏小鼠誘導(dǎo)哮喘模型，通過(guò)檢測(cè)各組小鼠肺功能及炎性細(xì)胞因子的變化，探究白藜蘆醇對(duì)哮喘小鼠肺功能及氣道炎癥的治療作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

90只SD級(jí)6周齡Balb/c雌性小鼠(購(gòu)自山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心)，體質(zhì)量12～20 g，按隨機(jī)雙盲分為對(duì)照組、哮喘組及白藜蘆醇組3組，每組為30只。哮喘組和白藜蘆醇組予卵蛋白(ovalbumin, OVA)致敏及誘導(dǎo)哮喘，對(duì)照組以生理鹽水代替；白藜蘆醇組在最后1周霧化前1 h給予白藜蘆醇5 mg/kg腹腔注射。哮喘模型制備參照HONDA方法制作[6]。OVA由Sigma公司提供；ELISA試劑盒(購(gòu)于武漢華美生物科技公司提供)； TRIzol總RNA提取試劑、SuperQuickRT cDNA第一鏈合成試劑盒(For Real-time PCR)、UltraSYBR Mixture(with ROX)購(gòu)自于康為世紀(jì)公司，980超聲霧化儀器(由新天緣設(shè)備公司生產(chǎn) 上海)；基因擴(kuò)增儀；實(shí)時(shí)定量PCR儀。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 肺功能檢測(cè)： 水合氯醛麻醉小鼠，氣管切開(kāi)，套管針置入、固定，將小鼠放入密閉的箱子中，按指標(biāo)連接管道。機(jī)械通氣參數(shù)：呼吸頻率為90次/min，潮氣量5.6 ml/kg。呼吸壓力為-8 cmH2O (1 cm=0.098 kPa)，記錄跨肺壓、流速，潮氣量容積的變化，用計(jì)算機(jī)計(jì)算用力最大流速(peak expiratory flow, PEF)、FEV0.4/FVC時(shí)用5倍潮氣量進(jìn)行機(jī)械通氣，-8 cmH2O負(fù)壓輔助呼氣，氣道反應(yīng)性以肺阻力(resistance of lung, RL)表示。

3. 組織處理： 處死小鼠后取出肺組織于10%中性甲醛中固定，經(jīng)脫水、包埋制成蠟塊并制作病理切片，HE染色觀(guān)察。

4. 白細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)： 取小鼠內(nèi)眥靜脈血，收集于含有肝素鈉的EP管中，用PBS稀釋后涂片，進(jìn)行白細(xì)胞及嗜酸性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5. 細(xì)胞炎性因子： 處死小鼠后小鼠氣管中注入0.3%的生理鹽水0.5 ml行支氣管肺泡灌，共3次，并收集肺泡灌洗液，以離心半徑8 cm 1 000 r/min離心10 min，收集上清保存待測(cè)。ELISA法檢測(cè)氣道炎癥因子的濃度 。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、各組小鼠肺組織病理學(xué)改變

對(duì)照組氣道黏膜正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無(wú)黏液分泌及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)殘缺，有大量黏液分泌，支氣管壁及血管周?chē)写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)；白藜蘆醇組小鼠黏膜水腫、肺泡壁殘缺、黏液分泌及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度均比哮喘組輕，見(jiàn)圖1。

二、肺功能變化

哮喘組小鼠肺功能指標(biāo)PEF(7.26±0.23)、FEV0.4/FVC(1.42±0.09)均高于對(duì)照組小鼠PEF(12.42±0.28)、FEV0.4/FV(2.25±0.12)(P<0.05);白藜蘆醇組指標(biāo)PEF(9.54±0.26)、FEV0.4/FVC(1.92±0.11)則明顯低于哮喘組指標(biāo)PEF(7.26±0.23)、FEV0.4/FVC(1.42±0.09)(P<0.05)。哮喘組氣道反應(yīng)性RL(2.12±0.10)高于對(duì)照組氣道反應(yīng)性RL(1.64±0.09)，白藜蘆醇組哮氣道反應(yīng)性RL(1.18±0.09)低于哮喘組RL(2.12±0.10)，見(jiàn)圖2。

三、血清中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及百分比

哮喘組血清中白細(xì)胞(59.87±27.76)、嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)(28.24±10.82)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(5.04±2.84)均明顯高于對(duì)照組血清中白細(xì)胞(26.83±2.14)、嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)(1.57±0.98)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(4.78±1.65)(P<0.05);白藜蘆醇組血清中白細(xì)胞(35.16±17.23)、嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)(28.24±15.54)、嗜酸性粒細(xì)胞百分比(4.82±1.76)則明顯低于哮喘組(P<0.05) ，見(jiàn)表1。

表1 白細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

四、BALF中IL-4、IL-5及IFN-γ的表達(dá)含量

哮喘組肺泡灌洗液中IL-4(65.28±3.76)及IL-5(87.98±4.83)在蛋白水平表達(dá)均明顯高于對(duì)照組IL-4(39.62±2.84)及IL-5(62.74±3.96)在蛋白水平的表達(dá)(P<0.05)；白藜蘆醇組IL-4(47.19±3.13)及IL-5(72.16±3.42)在蛋白水平的表達(dá)則明顯低于哮喘組(P<0.05)，哮喘組肺泡灌洗液中IFN-γ(74.26±10.82)在蛋白水平表達(dá)明顯低于對(duì)照組(88.76±8.03)(P<0.05)，白藜蘆醇組肺泡灌洗液中IFN-γ(82.15±9.32)在蛋白水平表達(dá)高于哮喘組(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

討 論

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子參與并引起的以氣道炎癥、氣道重塑等病理生理改變?yōu)橹鞯穆匝装Y性疾病。而氣道炎癥在哮喘中發(fā)揮了主導(dǎo)作用[7-8]。一般認(rèn)為T(mén)H1/TH2平衡狀態(tài)的失衡可導(dǎo)致TH2細(xì)胞因子分泌增多[9]，而TH1細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子 T-bet 的作用下分化成熟，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答并且能夠增強(qiáng)炎癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，進(jìn)而引起氣道黏膜損傷及炎癥反應(yīng)激活[10]。TH2細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子 GATA3 的作用下分化成熟，主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答并且能夠促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)浸潤(rùn)，進(jìn)而增加 IgE 的分泌并增加氣道反應(yīng)性[11]?？乖援愇锔腥旧矬w，免疫細(xì)胞通過(guò)識(shí)別、攝取等一系列免疫應(yīng)答機(jī)制激活TH2細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞合成并釋放大量以IL-4、IL-13等TH2型細(xì)胞因子，這些細(xì)胞介質(zhì)分泌到胞外介導(dǎo)Ⅱ型免疫應(yīng)答[12]。另一方面，這些細(xì)胞因子能活化血管內(nèi)皮黏附因子[13]，使中心粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞趨化到組織病變部位，活化的中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶溶解周?chē)M織，作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致血管通透性升高，促使大量的炎癥細(xì)胞從血管內(nèi)進(jìn)入組織液、病變組織中[14]，并合成及分泌大量、充足的Ⅱ型細(xì)胞因子，使發(fā)病機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能失衡，誘發(fā)及加重支氣管哮喘。支氣管哮喘持續(xù)反復(fù)的發(fā)作，會(huì)加重氣道氣管結(jié)構(gòu)的改變[15]，引起氣道狹窄、氣流受限，嚴(yán)重著肺功能會(huì)出現(xiàn)通氣性和彌散性功能障礙，引起PEF、FEV1/FVC降低、氣道反應(yīng)性增高等表現(xiàn)。TNF-α、IFN-γ、IL-2 是 TH1合成和分泌的細(xì)胞因子，具有促炎因子的活性，能夠促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的激活并增強(qiáng)多種炎癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[16]。

白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種天然小分子化合物，稱(chēng)為非黃酮類(lèi)多酚化合物[17-18]，多項(xiàng)研究 發(fā)現(xiàn)其對(duì)炎癥、腫瘤等多種疾病中具有良好的治療作用，這可能與其具有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤活性以及改善細(xì)胞內(nèi)能量代謝等作用有關(guān)。Birrell等[19]證明白藜蘆醇在脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺損傷中具有抗炎的作用。李玉屏[20]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可減輕COPD患者組織細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡。而支氣管哮喘本身也是多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的慢性炎癥，基于白藜蘆醇的抗炎、抗氧化等作用，本實(shí)驗(yàn)提出了是否其對(duì)支氣管哮喘也具有一定的抗炎及改善氣道重塑作用的假說(shuō)。

本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠氣道黏膜正常，肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，無(wú)黏液分泌及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)；哮喘組小鼠氣道黏膜充血水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)殘缺，有大量黏液分泌，支氣管壁及血管周?chē)写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)。氣道炎癥的存在加重氣道的高反應(yīng)性和氣道重塑，導(dǎo)致氣道痙攣及狹窄，進(jìn)而引起肺功能的降低。炎癥細(xì)胞因子及物質(zhì)是損傷氣道上皮和肺組織，引起氣道上皮剝離和氣道高反應(yīng)的主要因素[21-23]。本實(shí)驗(yàn)哮喘組外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和所占百分比高于對(duì)照組，且肺功能FEV0.4/FVC、用力最大流速及呼氣阻力低于對(duì)照組，哮喘組BALF及肺組織中TH2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5濃度高于對(duì)照組，而哮喘組IFN-γ的濃度低于對(duì)照組，表明多種炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞組分的失衡參與了哮喘的發(fā)生及發(fā)展。

糖皮質(zhì)激素在哮喘的急性發(fā)作期是最有效的緩解藥物[24]，主要作用機(jī)制在于抑制細(xì)胞炎性因子的合成及釋放，阻止炎癥細(xì)胞的趨化等，但用藥時(shí)間長(zhǎng)，產(chǎn)生的副作用較多[25-26]。近年來(lái)，中藥治療哮喘逐漸成為研究熱點(diǎn)，然而中藥制劑中有效成分、作用方式等具體機(jī)制尚不明確。哮喘的發(fā)病與多種炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子及炎性細(xì)胞的活動(dòng)有關(guān)。因此從調(diào)整機(jī)體免疫功能及抗炎癥因子的釋放的途徑來(lái)治療哮喘，成為選擇中藥治療哮喘方向。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取具有抗炎及具有免疫調(diào)節(jié)作用的中藥白藜蘆醇，白藜蘆醇是一種多酚類(lèi)化合物，在自然界中普遍存在，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗脂質(zhì)過(guò)氧化及抗氧化應(yīng)激等多種藥理活性。本文中給予誘導(dǎo)哮喘的小鼠白藜蘆醇腹腔注射，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇組外周血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)和所占百分比較哮喘組明顯減低，且肺功能FEV0.4/FVC、用力最大流速及呼氣阻力比哮喘組明顯提高；白藜蘆醇組BALF及肺組織中TH2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5濃度低于哮喘組，而TH1型細(xì)胞因子IFN-γ濃度高于哮喘組，說(shuō)明白藜蘆醇可能通過(guò)維持TH1/TH2細(xì)胞因子的平衡及提高免疫功能抑制TH2型炎性因子的合成，而促進(jìn)TH1型炎性因子的合成與釋放，從而起到治療作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示中藥白藜蘆醇能夠抑制TH2型炎性因子IL-4、IL-5的合成，而促進(jìn)TH1型炎性因子IFN-γ的合成與釋放，維持TH1/TH2的平衡及提高免疫功能，改善肺功能。為支氣管哮喘治療提供了新措施。