王 銀，邱連建

(廣東深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，深圳 518033)

AKEY WORDS Yifeiqinghua granules, HPLC-ELSD, astragaloside IV, platycodin D, ophiopogonin D

益肺清化顆粒由黃芪、黨參、北沙參、麥冬、仙鶴草、拳參、敗醬草、白花蛇舌草、川貝母、紫菀、桔梗、苦杏仁、甘草共13味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒、化痰止咳的功效，適用于氣陰兩虛、陰虛內(nèi)熱型晚期肺癌的輔助治療[1]，目前臨床上主要治療非小細(xì)胞肺癌[2-7]。為了更好地控制其質(zhì)量，本試驗(yàn)基于該中成藥中沒(méi)有紫外吸收的成分進(jìn)行研究，分別選擇黃芪中的黃芪甲苷、桔梗中的桔梗皂苷D[8]、麥冬中的麥冬皂苷D[9]作為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)(HPLC-ELSD)法，首次建立了黃芪甲苷、桔梗皂苷D和麥冬皂苷D 3 種成分同時(shí)測(cè)定的方法；結(jié)果表明，該方法測(cè)定簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，可為益肺清化顆粒的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters e2695高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；BP211D 電子天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；ELSD-2000ES蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，美國(guó)奧泰公司；KQ2000超聲儀，昆山超聲儀器有限公司。

1.2試藥 黃芪甲苷(批號(hào)110781-201717，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.9%)、桔梗皂苷D(批號(hào)111851-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.0%)均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；麥冬皂苷D(批號(hào)170203，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.7%)，深圳菲斯生物科技有限公司；6批益肺清化顆粒(批號(hào)170608、170609、170610、171221、171222、171223)，北京華神制藥有限公司。乙腈、甲醇為色譜純，西格瑪奧德里奇公司；其他試劑為分析純，天津市康科德科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-水(20∶80)；體積流量1.0 ml/min；柱溫 30 ℃；ELSD 漂移管溫度 95 ℃，氣體流量 2.5 L/min，進(jìn)樣量10 μl。

2.2溶液制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D適量，分別置50 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得各對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。再精密吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置50 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，得含黃芪甲苷15 μg/ml、桔梗皂苷D 10 μg/ml、麥冬皂苷D 5 μg/ml的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2供試品溶液制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，取適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱(chēng)定，加甲醇50 ml，索氏提取2 h，蒸干提取液，殘?jiān)?0 ml水溶解，用水飽和的正丁醇萃取3次，每次20 ml，合并萃取液，蒸干，加甲醇50 ml溶解，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液制備 按益肺清化顆粒處方比例和工藝，分別制備缺少黃芪、桔梗、麥冬藥材的陰性對(duì)照樣品；并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備各陰性對(duì)照溶液。

2.3專(zhuān)屬性試驗(yàn) 移取上述“2.2”項(xiàng)下的各溶液適量，依法進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液中測(cè)定成分黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D分離度良好，均符合《中國(guó)藥典》2015年版四部的要求，各陰性樣品溶液在所測(cè)成分相應(yīng)的位置處未見(jiàn)色譜峰，說(shuō)明陰性樣品溶液對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾。見(jiàn)圖1。

2.4線性關(guān)系考查 精密吸取按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0和10.0 ml，分別置 50 ml量瓶中，以甲醇定容，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。分別吸取上述系列混合對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積積分值(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，見(jiàn)表1。

表1 3種成分的線性回歸方程

2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，黃芪甲苷、桔梗皂苷D和麥冬皂苷D的峰面積的RSD值分別為1.5%、1.3%和1.7%，表明精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批益肺清化顆粒(批號(hào)170608)6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示，黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.121、0.311和0.053 mg/g，RSD 分別為1.5%、1.4%和1.7%，表明方法的重復(fù)性良好。

1.桔梗皂苷D 2.黃芪甲苷 3.麥冬皂苷D

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(批號(hào)170608)各10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、18和24 h 進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果顯示，黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.1%、1.0%和1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8加樣回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品(批號(hào)為170608，黃芪甲苷含量0.12 mg/g、桔梗皂苷D含量0.3 mg/g、麥冬皂苷D含量0.05 mg/g)9份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)定，分成3組，每組分別加入0.8、1.0和1.2 ml的對(duì)照品溶液(黃芪甲苷含量0.122 mg/ml、桔梗皂苷D含量0.311 mg/ml、麥冬皂苷D含量0.051 mg/ml),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D的平均回收率分別為99.59%、99.88%和100.16%，RSD分別為1.39%、0.68%和2.39%。見(jiàn)表2-4。

表2 黃芪甲苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表3 桔梗皂苷D加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表4 麥冬皂苷D加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9耐用性考查 取批號(hào)為170608的益肺清化顆粒適量，照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法配制，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖?？疾橹鶞?28、30和32 ℃)、體積流量(0.9、1.0和1.1 ml/min)變化及不同批號(hào)色譜柱變化對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，柱溫和體積流量的微小變化及色譜柱批號(hào)的改變對(duì)樣品的測(cè)定無(wú)明顯影響，表明耐用性良好。

2.10樣品測(cè)定 取收集到的6批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D的量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品中黃芪甲苷、桔梗皂苷D、麥冬皂苷D的含量 mg/g

3 討論

試驗(yàn)中，首先對(duì)色譜條件進(jìn)行了篩選，重點(diǎn)考查了流動(dòng)相乙腈-水體系與甲醇-水體系，最終優(yōu)選乙腈-水體系；對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最終的流動(dòng)相為乙腈-水(20∶80)；同時(shí)對(duì)柱溫、流速、漂移管溫度、氣體流量等條件進(jìn)行了篩選。最后，色譜條件確定后，對(duì)C18色譜柱進(jìn)行了篩選，基于SB-C18柱的峰形最優(yōu)，優(yōu)選其為最終的色譜柱。

此外，本試驗(yàn)考查了超聲提取和索氏提取兩種提取方式，結(jié)果索氏提取的效率比較高；進(jìn)一步對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了考查，分別考查了30、60、120和150 min，最終確定提取時(shí)間為120 min。