楊妮，白鄭海，邱曉娟，楊寧，張麗，武苗苗，裴紅紅，張正良

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，西安710000)

急性胰腺炎(AP)是因胰蛋白酶消化自身胰腺組織而引起的嚴(yán)重的急性腹部病癥。大多數(shù)AP患者病癥較輕，并無(wú)并發(fā)癥發(fā)生，然而約有20%的患者伴有炎癥反應(yīng)、繼發(fā)感染等多種并發(fā)癥，且癥狀較重，病死率較高[1]。目前對(duì)于A(yíng)P的診斷主要通過(guò)測(cè)定血清淀粉酶、尿胰蛋白酶原-2、降鈣素原、IL-6等，但不同的檢測(cè)標(biāo)志物均存在患者適用、診斷試劑等不同的條件限制[2～4]。尋找更為有效的生物標(biāo)志物對(duì)AP的早期診斷和預(yù)后具有重要意義。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是從蛋白質(zhì)整體水平探討正常與病理?xiàng)l件下蛋白譜表達(dá)差異，為尋找各種疾病早期特異性生物標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)[5]。本研究采用非標(biāo)記質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析AP患者與正常人尿液中蛋白譜表達(dá)差異，為篩選AP生物標(biāo)志物提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1～3月我院收治的AP患者15例(AP組)，男8例、女7例，年齡27～79(50.5±15.0)歲，體質(zhì)量(63.9±7.8)kg，肌酐(66.3±18.3)μmol/L，尿素氮(4.5±2.1)mmol/L。均符合AP診治指南(2014版)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，無(wú)其他嚴(yán)重并發(fā)癥。排除住院期間死亡及合并其他嚴(yán)重疾病者。對(duì)照組為15例查體健康者，男8例、女7例，年齡25～77(48.6±17.0)歲，體質(zhì)量(61.7±11.3)kg。本研究經(jīng)由西安交通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器與試劑 垂直電泳儀(英國(guó)GE-Healthcare公司)；Q-Exactive質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Finnigan公司)；EASY-nLC1000液相色譜(美國(guó)Thermo Finnigan公司)。

1.3 樣品收集與總蛋白質(zhì)提取 收集受試者入院時(shí)的尿液樣本，AP組與對(duì)照組各隨機(jī)分為3個(gè)小組，每小組5例樣本混合成為一份標(biāo)本，離心取上清，3 kD超濾管超濾濃縮。采用100 mmo/L碳酸氫銨溶液清洗3次，離心濃縮至200 μL，加入100 μL SDT裂解液，沸水浴15 min后，超聲處理。采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量檢測(cè) 每組樣品各取10 μL，按體積比5∶1加入5×上樣緩沖液，沸水浴5 min，14 000 g離心10 min，取上清，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析。電泳分離后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色、脫色，分析蛋白條帶，檢測(cè)所提取蛋白樣品的質(zhì)量。

1.5 差異表達(dá)蛋白的篩選與鑒定 采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)和生物信息學(xué)分析法。通過(guò)超濾、FASP酶解、萃取、離心、脫鹽、HPLC分離等步驟，采用Q-Exactive系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)譜分析。將LC-MS/MS原始文件導(dǎo)入Maxquant軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot_homo sapiens_181611_20170713.fasta。所得文件采用Perseus1.3.0.4軟件進(jìn)行分析，采用IBAQ算法進(jìn)行定量分析，蛋白定性篩選標(biāo)準(zhǔn)為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.01。組間蛋白差異采用t檢驗(yàn)，以>2或<0.5差異倍數(shù)為差異表達(dá)蛋白。數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。差異蛋白質(zhì)通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)(David 6.7和QuickGO)進(jìn)行GO功能注釋分析，用KEGG軟件進(jìn)行通路分析，用perseus軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析。選取上步篩選出的差異表達(dá)蛋白，采用Western blotting法測(cè)量其在A(yíng)P組和對(duì)照組中的表達(dá)情況，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩組差異表達(dá)蛋白篩選結(jié)果 共發(fā)現(xiàn)334個(gè)蛋白質(zhì)，其中57個(gè)蛋白存在差異表達(dá)，AP組有28個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，29個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)(表1、2)；另外有9個(gè)蛋白只在A(yíng)P組表達(dá)，73個(gè)蛋白只在對(duì)照組表達(dá)(表3、4)。

表1 AP組中發(fā)生上調(diào)的蛋白表達(dá)譜(前10位)

2.2 差異表達(dá)蛋白的功能活性分析結(jié)果

2.2.1 GO功能分析 將差異蛋白進(jìn)行GO功能分析，結(jié)果顯示差異蛋白所參與生物學(xué)過(guò)程主要為對(duì)刺激的應(yīng)答、免疫、代謝以及其他細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控等，分子功能則以結(jié)合與催化活性為主，而差異蛋白質(zhì)細(xì)胞組分分析主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞器以及細(xì)胞外區(qū)域。

2.2.2 KEGG通路分析 將差異蛋白進(jìn)行KEGG通路分析，共發(fā)現(xiàn)9個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝通路，分別是細(xì)胞黏著緊密連接通路、溶酶體激活通路、細(xì)胞凋亡通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體互作通路、補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移通路、系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)?、神?jīng)膠質(zhì)瘤通路、心律失常性心肌病等相關(guān)通路。

表2 AP組中發(fā)生下調(diào)的蛋白表達(dá)譜(前10位)

表3 只在A(yíng)P組表達(dá)的蛋白

表4 只在對(duì)照組表達(dá)的蛋白(前10位)

2.3 顯著差異蛋白的篩選與鑒定結(jié)果 根據(jù)蛋白表達(dá)差異倍數(shù)及GO、KEGG分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)糖蛋白CD59、免疫球蛋白重鏈IGHA2被富集在差異最顯著的類(lèi)別(細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞外區(qū)域以及結(jié)合活性)。經(jīng)Western blotting檢測(cè)，AP組尿液中CD59蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高，IGHA2蛋白表達(dá)較對(duì)照組降低(P均<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 AP組與對(duì)照組尿液中CD59、IGHA2蛋白表達(dá)水平比較

注：與對(duì)照組比較，*P均<0.05。

3 討論

AP的發(fā)病機(jī)制涉及胰腺自身消化、炎癥介質(zhì)、腸道細(xì)菌易位、細(xì)胞凋亡等許多過(guò)程。病變過(guò)程中，機(jī)體免疫系統(tǒng)以及各類(lèi)細(xì)胞因子均參與反應(yīng)，各類(lèi)因子及中間介質(zhì)在血液、尿液等體液中的含量也會(huì)發(fā)生變化[7～9]。因此，這些蛋白因子的水平變化或可為尋找更為有效的AP生物標(biāo)志物帶來(lái)新的方向[10～13]。本研究采用非標(biāo)記質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析AP患者與正常人尿液中蛋白譜表達(dá)差異，結(jié)果顯示，糖蛋白CD59、免疫球蛋白重鏈IGHA2被富集在差異最顯著的類(lèi)別，這兩種蛋白有望成為AP的特異性生物標(biāo)志物。

CD59是位于細(xì)胞表面的糖蛋白，可通過(guò)糖基磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)合于細(xì)胞膜，在各類(lèi)造血細(xì)胞、組織細(xì)胞、胎盤(pán)等多種類(lèi)型細(xì)胞表面均有存在，并廣泛游離分布于唾液、尿液、淚液等體液中。已知CD59的功能多樣，其主要功能與補(bǔ)體活化的調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。CD59作為一種膜結(jié)合補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白，可在補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末段，與補(bǔ)體攻膜復(fù)合物中的C8和C9相互作用而結(jié)合，阻止補(bǔ)體攻膜復(fù)合物的形成，從而抑制補(bǔ)體的活化過(guò)程。此外，CD59蛋白也參與T細(xì)胞黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程的調(diào)控[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，CD59蛋白在A(yíng)P患者尿液中的表達(dá)水平高于正常對(duì)照者。Lindstr?m等[15，16]報(bào)道，在重癥AP患者的血清中，補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD59水平明顯上升，表明CD59水平增高可能與AP的發(fā)生存在正向關(guān)系。此外，CD59蛋白被發(fā)現(xiàn)在多種病理?xiàng)l件下均呈現(xiàn)出高水平表達(dá)趨勢(shì)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌基質(zhì)細(xì)胞、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等病變組織中均能檢測(cè)到CD59蛋白高表達(dá)，其可能參與腫瘤形成過(guò)程中逃避補(bǔ)體攻擊及炎癥反應(yīng)的作用[14，16]。

補(bǔ)體是機(jī)體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)及防御機(jī)制，可介導(dǎo)機(jī)體免疫防御反應(yīng)，也可發(fā)揮溶解細(xì)胞作用，殺傷病損細(xì)胞，是體內(nèi)重要的效應(yīng)放大系統(tǒng)[17]。本研究結(jié)果顯示，AP患者尿液中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)也參與補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路，說(shuō)明補(bǔ)體系統(tǒng)在A(yíng)P發(fā)病過(guò)程中扮演著重要作用。因此，AP患者尿液中CD59蛋白水平的升高或與患者體內(nèi)補(bǔ)體防御機(jī)制的受損有關(guān)。

機(jī)體免疫功能的改變也與AP的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白重鏈在A(yíng)P患者尿液中的表達(dá)水平較正常對(duì)照者下降。已有研究證實(shí)，AP的預(yù)后以及其他并發(fā)癥的發(fā)生、病情的轉(zhuǎn)歸等均與免疫功能變化有關(guān)[11]。單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞以及多種白介素等均參與胰腺炎的病理學(xué)過(guò)程，其中炎癥介質(zhì)IL-6被證明為AP診斷的有效因子之一，可在A(yíng)P患者入院12～24 h內(nèi)檢出，且在重癥AP患者中具有較高的敏感性及特異性[2]。而免疫球蛋白在細(xì)胞膜、細(xì)胞器、細(xì)胞外區(qū)域以及結(jié)合活性等方面均存在作用，其表達(dá)水平的變化對(duì)急性炎癥疾病的發(fā)生具有重要作用。因此推測(cè)，免疫球蛋白重鏈或可作為AP的潛在生物標(biāo)志物，以反映胰腺炎患者免疫功能的改變。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)在A(yíng)P患者與正常人群的尿液中存在較大的蛋白表達(dá)差異，有數(shù)十種蛋白發(fā)生顯著的表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，也有許多蛋白只在正常人群或AP患者尿液中出現(xiàn)，例如胰分泌性胰蛋白酶抑制子SPINK1、泌乳素誘導(dǎo)蛋白PIP、凝血因子Ⅹ、補(bǔ)體相關(guān)因子CFHR2/CFD、以及載脂蛋白D、磷酸肌醇3激酶、谷氨酰胺酰肽環(huán)轉(zhuǎn)移酶、谷氨酰氨基肽酶、羧肽酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶、脫氧核糖核酸酶、絨毛膜促性腺激素、胸腺素等與糖/脂/蛋白質(zhì)代謝、激素分泌等相關(guān)的蛋白物質(zhì)。這些差異表達(dá)的蛋白主要定位于細(xì)胞膜、細(xì)胞器以及細(xì)胞外區(qū)域，參與了細(xì)胞連接、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控、補(bǔ)體及凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、細(xì)胞粘連/遷移、溶酶體激活等細(xì)胞學(xué)過(guò)程的調(diào)控，在A(yíng)P病變過(guò)程中發(fā)揮著基礎(chǔ)的級(jí)聯(lián)和促進(jìn)作用，是病變發(fā)生的主要分子基礎(chǔ)。對(duì)這些差異表達(dá)蛋白功能的深入研究有助于探明AP的發(fā)病機(jī)制、尋找合理的診斷和治療手段。

綜上所述，AP患者與健康人的尿液蛋白質(zhì)譜存在差異，糖蛋白CD59、免疫球蛋白重鏈IGHA2可能作為AP的特異性生物標(biāo)志物。本研究也證實(shí)，采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找AP的潛在生物標(biāo)志物是有效和可行的，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析，為進(jìn)一步探索AP診斷標(biāo)記物提供了方向。