孟子愉，朱恩東

(天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津市代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070)

自身免疫性肝炎是由自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病，其病因目前尚未明確[1～3]。糖皮質(zhì)激素單用或與硫唑嘌呤聯(lián)用是目前治療自身免疫性肝炎的標(biāo)準(zhǔn)療法，但患者常出現(xiàn)血細(xì)胞減少、骨質(zhì)疏松、糖尿病等不良反應(yīng)。隨著對(duì)該病研究的逐漸深入，尋找新的治療方式成為研究熱點(diǎn)。微小RNA(miRNAs)是由20～25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNAs，通過(guò)結(jié)合靶基因的3′UTR區(qū)引起mRNA降解，從而負(fù)向調(diào)控其功能。miRNAs可以影響細(xì)胞增殖、凋亡、黏附、遷移等生理過(guò)程，同時(shí)對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要調(diào)控作用[4]。研究表明，miR-20b在T淋巴細(xì)胞白血病、乳腺癌及多發(fā)性硬化癥等疾病進(jìn)程中均發(fā)揮調(diào)控作用[5～8]。但目前miR-20b在自身免疫性肝炎中作用的研究相對(duì)較少。2017年12月～2018年4月，我們采用刀豆蛋白(ConA)誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎，檢測(cè)血清和肝組織中炎癥因子水平，探討miR-20b對(duì)肝臟的保護(hù)作用，為自身免疫性肝炎的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)C57BL/6J品系野生型雄性小鼠52只，8～10周齡，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。HEK-293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。Ⅳ型ConA、吐溫-20購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；ALT檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Biologend公司；TRIzol、Lipofectamine2000購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；Prime Script RT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)于日本TaKaRa公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成設(shè)計(jì)；DMEM/H培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)GIBCO公司；Peg-It病毒濃縮液、miR-20b慢病毒構(gòu)建及包裝相關(guān)質(zhì)粒購(gòu)于美國(guó)SBI System Biosciences公司。構(gòu)建miR-20b慢病毒表達(dá)載體，點(diǎn)突變miR-20b與靶基因結(jié)合的種子序列而構(gòu)建得到對(duì)照載體。

1.2 動(dòng)物分組與造模 將小鼠隨機(jī)分成模型組16只、對(duì)照慢病毒組18只、miR-20b慢病毒組18只。模型組正常飼養(yǎng)，對(duì)照慢病毒組、miR-20b慢病毒組分別給予2×107U重組慢病毒對(duì)照載體和miR-20b慢病毒表達(dá)載體尾靜脈注射。7 d后三組均經(jīng)尾靜脈注射ConA 15 mg/kg誘導(dǎo)自身免疫性肝炎模型。

1.3 血清ALT水平檢測(cè) 采用賴(lài)氏法。取模型組7只、對(duì)照慢病毒組9只、miR-20b慢病毒組9只小鼠，于造模后6、12、18、24、36、48 h分別眼靜脈取血，離心取血清。樣品孔和對(duì)照孔各3個(gè)復(fù)孔，每孔加5 μL血清。樣品孔加入25 μL基質(zhì)液，對(duì)照孔不加。配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，加入96孔板中，37 ℃恒溫水浴30 min。水浴后，所有孔均加入25 μL二硝基苯肼，對(duì)照孔再加入25 μL基質(zhì)液，37 ℃恒溫水浴20 min。水浴后，所有孔均加入250 μL 0.4 mol/L NaOH終止反應(yīng)。多功能酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)在490 nm處吸光度值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出血清樣品中酶活力單位。

1.4 肝組織病理學(xué)檢查 采用HE染色法。造模后18 h，三組分別取2只小鼠處死，留取肝組織(主要病變區(qū))。加入4%甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。用玻片將蠟帶撈起，并使其貼在玻片上。晾干后進(jìn)行HE染色，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察組織病理情況。

1.5 血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平檢測(cè) 采用ELISA法。造模后2 h，三組分別取剩余的9只小鼠，摘眼球取血，離心取上清液。ELISA檢測(cè)前1日，酶標(biāo)板每孔加100 μL包被抗體，4 ℃過(guò)夜。次日每孔加入300 μL PBST洗板4次。每孔加入200 μL封閉液，室溫振蕩200 r/min，60 min。洗板4次，每孔加入100 μL血清及標(biāo)準(zhǔn)品，振蕩120 min。洗板4次，每孔加100 μL 二抗，振蕩60 min。洗板4次，每孔加100 μL 辣根過(guò)氧化物酶，振蕩30 min。洗板5次，每孔加100 μL底物，室溫避光孵育10～30 min。每孔加100 μL終止液，多功能酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)在450 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平。

1.6 肝組織IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。小鼠摘眼球放血后，留取肝組織。采用TRIzol法提取肝組織RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將獲得的cDNA按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)方法擴(kuò)增目的基因。引物序列：GAPDH上游5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′，下游5′-ACACATTGGGGGTAGGAACA-3′；IFN-γ上游5′-CACAGTCATTGAAAGCCTAGA-3′，下游5′-TTGCCAGTTC-CTCCAGATAT-3′；TNF-α上游5′-CTACTGAACTTCGGG-GTGAT-3′，下游5′-CAGGCTTGTCACTCG AATT-3′；IL-17A上游5′-TGAAGGCAGCAGCGATCA-3′，下游5′-GGAAGTCCTTGGCCTCAGTGT-3′；IL-4上游5′-GAAAA-CTCCATGCTTGAAGAA-3′，下游5′-TCTTTCAGTGATGTGGACTTG-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min預(yù)變性；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60～95 ℃緩慢升溫25 min產(chǎn)生融解曲線。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT水平比較 注射ConA后，模型組血清ALT水平6 h開(kāi)始升高，18 h左右達(dá)峰值，48 h左右基本恢復(fù)。與對(duì)照慢病毒組相同時(shí)間點(diǎn)相比，miR-20b慢病毒組血清ALT水平降低(P均<0.05)；模型組與對(duì)照慢病毒組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 三組肝組織病理情況 模型組和對(duì)照慢病毒組肝組織有一定面積的壞死區(qū)域，同時(shí)伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死；miR-20b慢病毒組僅有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)明顯壞死區(qū)域。

表1 三組造模后不同時(shí)間點(diǎn)血清ALT水平比較(U/L，x±s)

注：與對(duì)照慢病毒組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.3 三組血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平比較 與對(duì)照慢病毒組相比，miR-20b慢病毒組血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平降低(P均<0.05)；模型組與對(duì)照慢病毒組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 三組血清IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4水平比較

注：與對(duì)照慢病毒組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

2.4 三組肝組織中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照慢病毒組相比，miR-20b慢病毒組肝組織中IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達(dá)水平降低(P均<0.05)；模型組與對(duì)照慢病毒組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組肝組織IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4 mRNA表達(dá)比較(x±s)

注：與對(duì)照慢病毒組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

肝臟是人體的一種特殊器官，以代謝功能為主，負(fù)責(zé)清除體內(nèi)毒性產(chǎn)物、儲(chǔ)存糖原、合成蛋白等；同時(shí)也是重要的免疫器官，具有獨(dú)特的免疫微環(huán)境，富含大量免疫細(xì)胞，可識(shí)別外來(lái)毒素或病原微生物，通過(guò)免疫應(yīng)答清除外來(lái)有害物質(zhì)。肝臟是胸腺以外T細(xì)胞分化的重要場(chǎng)所，參與機(jī)體固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。自身免疫性肝炎以淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理特征，其臨床表現(xiàn)包括高γ-球蛋白血癥、血清轉(zhuǎn)氨酶升高和自身抗體陽(yáng)性等，其引起的急慢性肝損傷最終可導(dǎo)致肝纖維化、肝癌等高風(fēng)險(xiǎn)疾病。由于肝臟的免疫細(xì)胞間通過(guò)細(xì)胞因子、黏附分子及細(xì)胞間直接相互作用而形成一種獨(dú)特的網(wǎng)絡(luò)，因此深入研究肝臟的免疫調(diào)控機(jī)制尤為重要。研究表明，ConA、脂多糖、聚肌胞苷酸等均可誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎[3，9，10]。ConA所誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎主要由NKT細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞介導(dǎo)[3，11，12]，同時(shí)大量細(xì)胞因子也參與到免疫應(yīng)答之中，介導(dǎo)肝損傷的細(xì)胞因子主要包括IFN-γ、TNF-α、IL-4等；而IL-10、IL-15、IL-33等細(xì)胞因子起到負(fù)性調(diào)節(jié)作用[13]。

miRNAs參與多種病理及生理過(guò)程，可調(diào)控固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。miR-20b屬于miR-106a-363基因簇成員，位于人和小鼠的X染色體上[5]。研究顯示，miR-20b可能參與某些癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括肝癌、乳腺癌和胃癌等[14,15]。我們的前期研究表明，在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中，miR-20b可能通過(guò)抑制靶基因RORγt和STAT3的表達(dá)，從而抑制Th17細(xì)胞的分化，可延緩實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的疾病進(jìn)程[16]。但是目前有關(guān)miR-20b在自身免疫性肝炎中的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究結(jié)果顯示，ConA誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎后，血清ALT水平6 h開(kāi)始升高，18 h左右達(dá)峰值，48 h左右基本恢復(fù)，表明自身免疫性肝炎模型建模成功。與注射對(duì)照慢病毒組小鼠相比，注射miR-20b慢病毒小鼠血清ALT水平顯著降低，表明miR-20b在抵抗ConA誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

組織病理切片顯示，模型組和對(duì)照慢病毒組小鼠肝組織有一定面積的壞死區(qū)域，同時(shí)伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死；而注射miR-20b慢病毒組小鼠肝組織僅有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并未見(jiàn)明顯壞死區(qū)域，組織病理切片與血清ALT水平變化基本一致。

ConA所誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎過(guò)程中，介導(dǎo)肝損傷的炎癥因子主要包括IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17A等[3]。本研究結(jié)果顯示，與注射對(duì)照慢病毒組小鼠相比，注射miR-20b慢病毒組小鼠血清及肝組織中炎癥因子IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-4表達(dá)水平顯著降低，表明miR-20b對(duì)ConA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎進(jìn)程中的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。

綜上所述，miR-20b對(duì)自身免疫性肝炎小鼠的肝臟組織具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)從而降低肝損傷水平，其具體調(diào)控機(jī)制及相關(guān)靶基因有待進(jìn)一步研究。