張晨紅，王建峰，陳華，李曉寧

(陜西省核工業(yè)215醫(yī)院，陜西咸陽712000)

單純皰疹病毒(HSV)可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥，HSV-1通常引起單純皰疹病毒性腦炎(HSE)，HSV-2通常引起單純皰疹病毒性腦膜炎(HSM)[1]。HSE和HSM均表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，但HSE較HSM嚴重，如果治療不及時，往往會遺留永久后遺癥甚至急性期死亡。因此，及時鑒別HSE和HSM對于避免延誤治療和改善患者預后尤為重要。HSE和HSM中均發(fā)生CNS炎癥應答，主要表現(xiàn)為腦脊液淋巴細胞增多和蛋白含量增加[2]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細胞移行到感染部位依賴于趨化因子[3]，趨化因子調(diào)控著白細胞的遷移，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[4]。既往研究顯示，不同趨化因子在健康人群[5，6]、HSE[7]、蟲媒病毒性腦炎[8]和肺炎球菌腦膜炎[9]腦脊液中的水平不同，提示趨化因子在CNS炎癥過程中具有重要作用，但是目前尚缺乏趨化因子在鑒別HSE和HSM方面的相關報道。依據(jù)N端半胱氨酸殘基位置和數(shù)目，趨化因子分為4個亞族：CC亞族(28個成員，CCL1～CCL28)、CXC亞族(17個成員，CXCL1～CXCL17)、C亞族(2個成員，XCL1和XCL2)和CX3C亞族(惟一成員，CX3CL1)。本研究采用Bio-Plex懸液芯片技術，檢測HSE和HSM患者腦脊液和血清中30個趨化因子水平，分析HSE和HSM趨化因子水平的差異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：①年齡≥18歲；②具有CNS感染癥狀(如發(fā)熱、頭痛、頸強直、意識狀態(tài)改變、局灶性神經(jīng)癥狀或癲癇發(fā)作)；③HSE診斷標準采用國際共同聲明定義，即精神狀況改變(意識改變、昏睡、人格改變)持續(xù)時間>24 h，并具有下述表現(xiàn)中的至少3項：發(fā)病前72 h或發(fā)病后體溫≥38 ℃，癲癇發(fā)作，新發(fā)局灶性神經(jīng)缺損，腦脊液白細胞計數(shù)≥5×103/L，腦電圖異常[10]；同時患者入院時通過實時定量TaqMan PCR法檢測出HSV-1；④HSM診斷標準：臨床表現(xiàn)有腦膜刺激癥狀(頭痛、惡心或嘔吐、頸強直、腦膜刺激征陽性)，MR或CT改變排除腦炎，入院時通過實時定量TaqMan PCR法檢測出HSV-2 DNA[1]；⑤排除合并其他病毒性腦炎或腦膜炎。選擇2013年6月～2016年5月我院收治的符合上述納入標準的HSE和HSM患者各20例。HSE組男9例、女11例，年齡28～73歲、中位年齡45.0歲； HSM組男4例、女16例，年齡29～61歲、中位年齡41.5歲。另外選擇20例存在頭痛，但腦脊液常規(guī)和生化正常、細菌和病毒陰性的患者作為對照組，排除感染、自身免疫性疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病。對照組男10例、女10例，年齡23～66歲、中位年齡43.0歲。三組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，受試者簽署知情同意書。

1.2 趨化因子檢測方法 受試者在癥狀出現(xiàn)后的20 d內(nèi)采集腦脊液和血清標本，腦脊液標本離心去除細胞，與血清標本儲存于-70 ℃待測。采用Bio-Plex懸液芯片技術檢測腦脊液和血清中的30個趨化因子，即11個CXC亞族(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL16)，18個CC亞族(CCL1、CCL2、CCL3、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL17、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27)和CX3CL1。試劑盒購自Bio-Plex ProTM(Bio-Rad Laboratories)，按照說明書要求操作。通過Bio-Plex200系統(tǒng)測定，采取五參數(shù)Logistic標準曲線計算趨化因子水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。因本研究各組樣本數(shù)<50，因此計量資料選擇Shapiro-Wilk檢驗分析數(shù)據(jù)正態(tài)性。經(jīng)統(tǒng)計學分析，本研究全部數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，計量資料以中位數(shù)(M)表示。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。腦脊液和血清之間配對數(shù)據(jù)的比較采用Wilcoxon配對符號秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組腦脊液中趨化因子水平比較 見表1。對照組腦脊液中檢出CX3CL1和8個CXC亞族趨化因子(CXCL1、CXCL5、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL16)、5個CC亞族趨化因子(CCL1、CCL2、CCL15、CCL21和CCL25)。與對照組比較，HSE組腦脊液中有22個趨化因子水平增加，HSM組腦脊液中有25個趨化因子水平增加(P均<0.05)。與HSE組比較，HSM組腦脊液中CXCL5、CXCL8、CXCL11、CCL8、CCL13水平升高(P均<0.05)。

表1 三組腦脊液中趨化因子水平比較(pg/mL，M)

注：與對照組比較，*P<0.05；與HSE組比較，#P<0.05。

2.2 三組血清中趨化因子水平比較 見表2。對照組血清中檢出CX3CL1和全部11個CXC亞族趨化因子、全部18個CC亞族趨化因子。與對照組比較，HSE組血清中有7個趨化因子水平增加(P均<0.05)，HSM組血清中各趨化因子水平與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。全部趨化因子在HSE組和HSM組之間差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 HSM和HSE組腦脊液與血清中趨化因子濃度的比較 考慮到可能存在著依賴趨化因子濃度梯度而導致細胞從血液向腦脊液遷移的情況，我們對HSE組和HSM組患者腦脊液和血清中水平升高的趨化因子進一步分析，篩選腦脊液濃度/血清濃度>1的趨化因子。結果顯示，CXCL8、CXCL9和CXCL10在HSE和HSM組腦脊液中水平均升高，符合腦脊液濃度/血清濃度>1；CCL8和CXCL11僅在HSM組中腦脊液濃度/血清濃度>1，在HSE組中腦脊液/血清濃度均<1；其余趨化因子在HSM和HSE組中腦脊液/血清濃度均<1。

表2 三組血清中趨化因子水平比較(pg/mL，M]

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

依據(jù)病毒血清型，HSV引起的CNS炎癥分為HSE、HSM兩類。HSE的發(fā)生率為2/1 000 000～4/1 000 000，發(fā)病無性別差異；HSM的發(fā)生率為20/1 000 000～40/1 000 000，男女比例約為1∶6[1，11]。HSV-1主要引起唇部皰疹，經(jīng)由三叉神經(jīng)或顳葉嗅神經(jīng)節(jié)擴散到CNS繁殖。多數(shù)HSE患者核磁共振成像(MRI)可顯示上顳葉炎癥損害，臨床表現(xiàn)為高熱、頭痛、癲癇發(fā)作、定向力障礙和言語困難等癥狀。未進行抗病毒治療的HSE患者病死率超過70%，往往導致嚴重的神經(jīng)后遺癥。HSV-2通常引起生殖道黏膜感染，經(jīng)由骶神經(jīng)節(jié)傳播到CNS，HSM綜合征較HSE綜合征輕，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛頸強直、光過敏等。一般來說，HSE的臨床經(jīng)過較HSM嚴重，如果延誤診斷和治療，更容易發(fā)生急性期死亡和嚴重后遺癥。因此，尋找鑒別HSM和HSE的生物學標記，對于減少臨床誤診、漏診，提高診斷準確性并及時治療具有重要意義。

趨化因子具有趨化細胞的遷移、在免疫監(jiān)視中控制免疫細胞趨化、刺激炎癥細胞因子釋放等作用。既往研究顯示，單核細胞趨化因子CCL2、CX3CL1、CCL15、CCL20等在健康人CNS中表達[5,6]；我們在非CNS感染對照人群的腦脊液中也發(fā)現(xiàn)了部分趨化因子。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)了幾個趨化因子在腦脊液水平超過了血清中的穩(wěn)態(tài)水平，與對照組比較，CXCL8、CXCL9、CXCL10在HSE和HSM患者腦脊液中均增加，而CCL8和CXCL11僅在HSM患者腦脊液中顯著增加。

研究發(fā)現(xiàn)，細菌性腦膜炎患者腦脊液中CXCL8水平升高，同時伴隨著中性粒細胞增加，CXCL8的2個受體CXCR1和CXCR2表達于中性粒細胞表面，通過綁定而誘導中性粒細胞的遷移。R?sler等[7]報道，HSE患者腦脊液中CXCL8水平升高，并且在病程中長期穩(wěn)定存在。本研究結果顯示，HSE和HSM患者腦脊液中CXCL8水平高于血清，但是相比于HSE，在HSM腦脊液中的水平更高。

趨化因子受體CXCR3主要表達在CD4+和CD8+T細胞表面，可以與CXCL9、CXCL10、CXCL11結合，與CXCL11親和力最高[12]。CXCR3缺陷型小鼠對HSV-2的易感性增加，并且很快死亡[13]；但是在HSV-1感染小鼠，CXCR3缺陷卻對致命性CNS起到了保護作用[14]，提示CXCR3的作用或許依賴于小鼠的品系和組織特異性。與本研究結果相似，許多其他CNS炎癥腦脊液中CXCL9和CXCL10水平也升高[8]。但是，本研究發(fā)現(xiàn)CXCL11僅在HSM而不是HSE患者腦脊液中增多。其機制可能是HSM患者體內(nèi)單個核細胞分泌大量IFN-γ進入腦脊液，從而誘導CXCL11明顯增加。也可能存在其他機制，如CXCL10和CXCL11啟動子包含IRSE元件，但是CXCL9啟動子則沒有IRSE元件；STAT3-STAT1異源二聚體綁定到CXCL11啟動子，但是STAT1-STAT2異源二聚體綁定到CXCL9和CXCL10啟動子[12]。其具體機制仍需進一步研究。

CCL8參與Th2應答，與淋巴細胞、單核細胞遷移相關，刺激嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞增殖。本研究結果顯示，CCL8僅在HSM腦脊液中增加。此外，CCL8也高表達于肺炎球菌腦膜炎[9]，但是在產(chǎn)單核李斯特菌腦膜炎的腦脊液中是陰性的。關于CCL8的研究目前相對較少，其在HSM腦脊液中增高的意義仍有待進一步充實。

總之，本研究顯示HSE和HSM腦脊液中趨化因子水平不同。盡管HSE病情較HSM更嚴重，但是HSM腦脊液中存在更多的趨化因子。CXCL8、CXCL9和CXCL10在HSE和HSM患者腦脊液中增多，但是僅HSM患者腦脊液中CCL8和CXCL11升高。推測CCL8和CXCL11可作為鑒別HSM和HSE的潛在指標。