洪穎 段勇 徐秋月

doi：10.3969/j .issn.1007 -614x.2018.5.1

摘要 本文介紹環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）原理、特點(diǎn)及應(yīng)用前景。因LAMP具有特異性高、靈敏度高、易操作、污染風(fēng)險(xiǎn)低的特點(diǎn)，因而目前在傳染病、真菌、細(xì)菌，檢測(cè)領(lǐng)域中作為診斷工具得到了認(rèn)可。

關(guān)鍵詞 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；研究；應(yīng)用

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是在20世紀(jì)90年代核酸擴(kuò)增技術(shù)研究及應(yīng)用基礎(chǔ)上，逐漸提出并廣泛應(yīng)用的一種新的技術(shù)方式，它在實(shí)際應(yīng)用中能夠根據(jù)靶基因6個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行4種特異引物設(shè)計(jì)，并通過恒溫環(huán)境以鏈置換DNA聚合酶為反應(yīng)條件，實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增反應(yīng)。在反應(yīng)過程中，該技術(shù)不需要進(jìn)行長時(shí)間溫度循環(huán)以及紫外觀察、模板熱變性等較為繁瑣的反應(yīng)過程，具有簡(jiǎn)單、快捷以及特異性突出等技術(shù)特點(diǎn)，在生命科學(xué)研究以及相關(guān)領(lǐng)域中具有較廣泛的應(yīng)用價(jià)值[1]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其原理分析

LAMP在進(jìn)行DNA擴(kuò)增過程中，主要通過進(jìn)行4種不同特異性引物設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)靶基因的6個(gè)特定區(qū)域識(shí)別，同時(shí)在恒溫條件下完成擴(kuò)增反應(yīng)[2]。值得注意的是，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在進(jìn)行DNA擴(kuò)增過程中能夠?qū)⒒驍U(kuò)增與產(chǎn)物檢測(cè)同步實(shí)現(xiàn)，并且擴(kuò)增反應(yīng)的效率較高，一般15～ 60 min左右就能夠?qū)崿F(xiàn)109～1 010倍基因擴(kuò)增，并且該技術(shù)的特異性比較突出，對(duì)于靶基因序列的檢測(cè)，能夠只利用有無擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行判斷與識(shí)別，具有較為突出的技術(shù)特征與優(yōu)勢(shì)。

引物的設(shè)計(jì)：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在擴(kuò)增反應(yīng)應(yīng)用中，其引物設(shè)計(jì)主要是結(jié)合靶基因3端Flc、F2c、F3c區(qū)以及5端Bl、B2、B3區(qū)共6個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行4種特異性引物設(shè)計(jì)，即FIP、F3、BIP、B3共4種特異性引物例。其中，F(xiàn)IP屬于上游內(nèi)部引物，主要構(gòu)成于F2區(qū)，該區(qū)域和靶基因的3端F2c區(qū)一級(jí)5端Flc區(qū)分別呈互補(bǔ)與相同關(guān)系；而F3引物則為上游外部引物，主要構(gòu)成于F3區(qū)域，該區(qū)域和靶基因中的F3c區(qū)域呈互補(bǔ)關(guān)系；同時(shí)，BIP引物為下游內(nèi)部引物，B3引物為下游外部引物，它們分別構(gòu)成于靶基因的B2、B3區(qū)域，與靶基因的B2c、Blc、B3c區(qū)域呈互補(bǔ)或序列相同關(guān)系。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的靶基因區(qū)域與引物設(shè)計(jì)關(guān)系圖，見圖1。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)，主要是根據(jù)DNA在恒溫（約65℃）環(huán)境下的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，其包括啟動(dòng)和循環(huán)兩個(gè)階段：靶基因Flc和Fl互補(bǔ)，靶基因F2和F2c、 F3c和F3、B3c和B3、B2c和B2、Blc和Bl互補(bǔ)。F2和Flc組成了FIP，Blc和Bl互補(bǔ)成BIP；LF是正向環(huán)引物，可結(jié)合于Fl和F2之間的環(huán)結(jié)構(gòu)，使反應(yīng)速度加快；而作為反向環(huán)引物的LB，可結(jié)合于Bl和B2之間的環(huán)結(jié)構(gòu)，使反應(yīng)速度加快。啟動(dòng)階段時(shí)間很短，分子結(jié)合復(fù)制過程是由核酸等溫?cái)U(kuò)增通過全部6段特異序列來識(shí)別靶DNA，這6段特異序列來自4條特異引物，正常核酸擴(kuò)增啟動(dòng)的條件是這6段特異序列完全匹配。在全面擴(kuò)增的時(shí)間中，循環(huán)階段達(dá)>95%，對(duì)靶DNA識(shí)別依靠的是4段特異序列（FIP，BIP，LF和LB），只有這4段特異序列完全匹配才能進(jìn)行互補(bǔ)，進(jìn)行不斷循環(huán)擴(kuò)增，這樣就保證了核酸等溫?cái)U(kuò)增的特異性與準(zhǔn)確性，見圖2。

LAMP的產(chǎn)物分析：LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物是通過目測(cè)渾濁度、離心后對(duì)沉淀熒光染料進(jìn)行觀察和電泳這幾種方式來檢測(cè)。LAMP擴(kuò)增副產(chǎn)物為白色沉淀，即焦磷酸鎂，其可肉眼觀察。而LAMP反應(yīng)中焦磷酸鎂沉淀的形成與所產(chǎn)生的擴(kuò)增片段的量之間呈線性關(guān)系。因此對(duì)靶基因是否存在的判斷通過觀察反應(yīng)中白色沉淀的有無即可。LAMP熒光檢測(cè)試劑中的鈣黃綠素初始與錳離子結(jié)合以產(chǎn)生驟冷效應(yīng)。副產(chǎn)物的焦磷酸根與錳離子結(jié)合并從鈣黃綠素上帶走錳離子使其產(chǎn)生熒光，肉眼即可明顯觀察到。由此管內(nèi)出現(xiàn)熒光即表明目標(biāo)基因被大量擴(kuò)增。LAMP產(chǎn)物也可使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)形成一組梯狀帶。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的應(yīng)用研究

LAMP技術(shù)的發(fā)展與研究近年最主要在兩個(gè)方面：首先是在臨床上的實(shí)際應(yīng)用；其次是原有技術(shù)的不斷改進(jìn)。所以LAMP被發(fā)明以來許多的實(shí)驗(yàn)人員將其應(yīng)用于各種病原體的檢查并與各種PCR的方法進(jìn)行比較。因LAMP具有短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增相應(yīng)的靶序列且不需要特殊的精密儀器及實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)地，故被廣泛應(yīng)用在各種病原生物體及相關(guān)的疾病診斷上[4]。

傳染性疾病檢測(cè)的應(yīng)用及研究：當(dāng)前通過LAMP技術(shù)方式實(shí)現(xiàn)的病毒檢測(cè)項(xiàng)目主要包括乙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、流感病毒以及腮腺炎病毒、麻疹病毒、SARS冠狀病毒等[5]，同時(shí)，有研究顯示，在以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)以及聚合酶鏈反應(yīng)兩種不同方式進(jìn)行7種不同類型的人類皰疹病毒DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以焦磷酸鎂濁度檢測(cè)方式進(jìn)行檢測(cè)顯示，30 min的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)靈敏度約為500拷貝/管，而60 min的靈敏度達(dá)到250拷貝/管，并且只有HHV-7的DNA底物在反應(yīng)中生成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，其余情況均不能發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物[6]。并且其敏感的極限與PCR法比較可達(dá)到10的拷貝數(shù)。由此可見，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)在傳染性疾病檢測(cè)中能滿足快速檢測(cè)的要求。

細(xì)菌檢測(cè)的應(yīng)用：LAMP首先是以16sRNA這段保守序列作為靶基因，成功的設(shè)計(jì)出可同時(shí)檢測(cè)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌和無乳鏈球菌的引物[7、8]，因LAMP的高度特異性，故這4種細(xì)菌與其他的細(xì)菌都不會(huì)發(fā)生交叉反應(yīng)。而對(duì)于結(jié)核分枝桿菌，LAMP可從口痰中鑒定出來，操作非常的（簡(jiǎn)單）方便，僅僅將所有的混合反應(yīng)物放于63℃孵育，并在反應(yīng)的試管中加入SYBR Green I，若有擴(kuò)增產(chǎn)物則呈綠色。并且LAMP無論是在固體培養(yǎng)基還是液體培養(yǎng)基中都能培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，大大縮短了傳統(tǒng)鑒定結(jié)核桿菌的時(shí)間。

真菌檢測(cè)的應(yīng)用：肺孢子菌是一種具有宿主特異性的機(jī)會(huì)感染致病菌[9]，引起的肺孢子菌肺炎（PCP）臨床體征不明顯且病原學(xué)診斷不特異，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道用LAMP的方法檢測(cè)PCP患者的口痰及肺泡灌洗液的肺孢子菌的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR的方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)作為一種新的核酸擴(kuò)增方法，本身具有較突出的特異性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，并且在反應(yīng)的初期，核酸擴(kuò)增儀6n倍量進(jìn)行擴(kuò)增，30～ 60min即可擴(kuò)增出109～1 010拷貝的目的基因來，具有高效的靈敏度，比傳統(tǒng)的PCR高出2～3個(gè)數(shù)量級(jí)，并且結(jié)果判定肉眼即可完成。在病毒和細(xì)菌容易變異的今天，LAMP技術(shù)可最大程度滿足臨床快速診斷需要。隨著LAMP技術(shù)的不斷完善和改進(jìn)，相信LAMP技術(shù)會(huì)在快速檢測(cè)感染性疾病方面有著更為廣闊的前景。

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