何蘭 何軍 俞俊嶺 龔磊 侯賽 朱夢(mèng) 李衛(wèi)東

230601合肥,安徽省疾病預(yù)防控制中心

近年來(lái)流感病毒對(duì)人類健康的危害已經(jīng)越來(lái)越引起關(guān)注，因?yàn)殡S著全球化趨勢(shì)的日益明顯，某一地區(qū)的季節(jié)性流感爆發(fā)常常會(huì)對(duì)全球人類的健康和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生非常大的影響[1-2]。乙型流感病毒每年都會(huì)在全世界范圍內(nèi)流行，幾乎占了流感疾病負(fù)擔(dān)的1/3[3]，特別在兒童群體中能夠引起嚴(yán)重的疾病后果[4-5]，1940年在1起兒童急性呼吸道傳染病疫情中首次發(fā)現(xiàn)該病毒[6]。根據(jù)乙型流感病毒表面蛋白的抗原特性和血凝素基因的序列特征可將其分為Victoria和Yamagata兩大譜系，代表株分別為B/Victoria/2/87和 B/Yamagata/16/88。另?yè)?jù)流行病學(xué)監(jiān)測(cè)資料顯示自2000年起兩個(gè)系別的病毒可在同一個(gè)流感流行季中共同循環(huán)[7-8]，在其交互流行或共同流行過(guò)程中，極有可能發(fā)生系間重配[9]。2001—2011年間(2009年除外)，美國(guó)流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示乙型流感陽(yáng)性樣本數(shù)約占流感陽(yáng)性樣本總數(shù)的1% ～43.6%，平均為24%；而歐洲同期為1% ～59.8%，平均為 23%[10]。本文通過(guò)研究 2017—2018年度安徽省內(nèi)流行的乙型流感病毒抗原性和基因特征，掌握該病原在安徽省的流行特征和分子進(jìn)化特點(diǎn)，分析流行毒株與WHO推薦疫苗株成分是否匹配，為流感監(jiān)測(cè)提供科學(xué)的防控依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 流感監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù) 根據(jù)《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》(2017年版)規(guī)定，一個(gè)流感監(jiān)測(cè)年度的時(shí)間區(qū)間為每年的4月1日至次年的3月31日。從中國(guó)流感監(jiān)測(cè)信息系統(tǒng)獲取2015—2016、2016—2017和2017—2018監(jiān)測(cè)年度安徽省流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)結(jié)果，所有流感樣病例樣本來(lái)自國(guó)家流感哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)醫(yī)院，并用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2 毒株來(lái)源 本研究的所有流感毒株均來(lái)自安徽省流感監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院采集的咽拭子標(biāo)本，分離病毒后送至安徽省流感參比中心，經(jīng)復(fù)核鑒定為乙型流感后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)操作和運(yùn)輸保存均按照《國(guó)家流感監(jiān)測(cè)方案(2017年版)》進(jìn)行。

1.3 病毒抗原性分析 參考抗原采用WHO推薦的國(guó)際疫苗代表株，參考抗原和參考抗血清均由中國(guó)國(guó)家流感中心制備下發(fā)。根據(jù)《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)技術(shù)指南》(2017年版)的標(biāo)準(zhǔn)判定要求，當(dāng)待檢病毒與參考雪貂抗血清的HAI效價(jià)低于參考病毒與參考抗血清自身HAI效價(jià)的8倍(含8倍)或以上時(shí)，

則認(rèn)為待檢病毒是該參考抗血清檢測(cè)到的低反應(yīng)株；反之，當(dāng)相差8倍以內(nèi)時(shí)(不含8倍)，則認(rèn)為待檢病毒是參考病毒的類似株。

1.4 一步法RT-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 OneStep RT-PCR試劑盒(CatNo:210212)Qiagen公司生產(chǎn)，反應(yīng)液配置組分:5倍RT-PCR Buffer為10μl；上游和下游20μmol/L的引物各為1μl；10 mmol/L dNTPMix為2μl；OneStep RT-PCR Enzyme Mix為2 μl；然后用無(wú)RNA酶水24μl補(bǔ)齊到40μl的體系總量，最后再加病毒核酸模板10μl。反應(yīng)條件為:第一階段 42℃10 min、50℃30 min、95 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)；第二階段94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72℃90 s，35個(gè)循環(huán)，；第三階段72℃10 min，1個(gè)循環(huán)。最后冷藏(4～8℃)保存。

1.5 全基因組序列測(cè)定 用瓊脂糖凝膠切割回收擴(kuò)增的產(chǎn)物，M13為測(cè)序引物，用BigDyeTMTerminator v3.1 Cycle Sequencing kit(AppliedBiosystemsTM，批號(hào):4337455)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序反應(yīng)后的產(chǎn)物使用BigDyeXTerminatorTMPurification Kit((AppliedBiosys temsTM，批號(hào):4376486)進(jìn)行純化，最后用基因測(cè)序儀(ABI 3730)開(kāi)展測(cè)序分析(測(cè)序工作外包有資質(zhì)的公司完成)。序列拼接和組裝由DNAMAN(ver sion 6)軟件完成。

1.6 序列分析 使用Mega6.0軟件中的Clustal W法做序列比對(duì)分析，Neighbor-joining法做遺傳進(jìn)化分析，再分析HA和NA蛋白的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)和變異位點(diǎn)。HA和NA進(jìn)化分析參考株參照方斌等[11]研究方法，選用歐洲疾病預(yù)防控制中心2017—2018年流感季的概況報(bào)告(https://ecdc.europa.eu)，Yamagata系 1～3分支參考株各是:B/Wisconsin/1/2010 及 B/Brisbane/3/2007、B/Florida/4/2006；Victoria系1B與1 A分支參考株是B/Hong Kong/514/2009及 B/Brisbane/60/2008。

2 結(jié)果

2.1 2015—2018年安徽省乙型流感流行情況 由圖1所示，安徽省乙型流感每年均有流行高峰，2015年7～8月份、2016年2月份、2016年11～12月份、2017年2月份、2017年8～9月份和2018年2月份均為甲型流感流行高峰月份；2015—2018年安徽省乙型流感Victoria和Yamagata兩大譜系呈交替流行，2015年1～3月份以Yamagata系為主，2016年2～5月份以Victoria系為主，而2017年2～5月份流行Victoria系，9月份以后Yamagata系流行占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)。由圖2所示，2015—2016流感監(jiān)測(cè)年度，WHO推薦B/Phuket/3073/2013(Yamagata系)為疫苗候選株，2015年12月份以后安徽省Yamagata系占全部乙型流感流行比例明顯下降；2016—2017年度B/Brisbane/60/2008(Victoria系)為疫苗候選株，該監(jiān)測(cè)年度安徽省仍以Victoria系乙型流感病毒為主要流行株；2017—2018年度疫苗候選株仍為Victoria系，安徽省Victoria系乙型流感自2017年7月份以后開(kāi)始下降，同期Yamagata系占比呈明顯上升態(tài)勢(shì)。

圖1 2015—2018年安徽省乙型流感病毒流行月分布Fig.1 Monthly distribution of influenza B virus in Anhui province from 2015 to 2018

圖2 2015—2018年安徽省乙型流感病毒流行月占比Note:Vaccine strains agains influenza B virus recommended by the WHO for trivalent vaccines in the Northern HemisphereFig.2 Lineage-specific statistics for influenza B viruses in Anhui province from 2015 to2018

2.2 2017—2018流感監(jiān)測(cè)年度安徽省乙型流感抗原性分析 從2017—2018流感監(jiān)測(cè)年度內(nèi)安徽省轄區(qū)內(nèi)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室送檢至省級(jí)流感參比中心的乙型流感毒株中，隨機(jī)選取了99株毒株進(jìn)行抗原性分析，其中Yamagata系90株，Victoria系9株。WHO推薦該年度的三價(jià)疫苗組分中乙型Victoria系毒株為B/Brisbane/60/2 008類似株，四價(jià)疫苗組分包含了Yamagata系的 B/Phuket/3073/2013類似株[12]，國(guó)家流感中心以B/Brisbane/60/2008和B/Phuket/3073/2 013分別免疫雪貂制備了參考抗血清，對(duì)上述挑選的99株乙型流感毒株進(jìn)行抗原性分析。Victoria系毒株抗原性分析結(jié)果顯示:9株毒株全部為B/Brisbane/60/2008的類似株，無(wú)低反應(yīng)株；Yamagata系毒株抗原性分析結(jié)果顯示:90株毒株中有84株(93.3%)為 B/Phuket/3073/2013的類似株，6株(6.7%)為低反應(yīng)株。

2.3 2017—2018安徽省乙型流感基因特征分析隨機(jī)選取本年度乙型流感毒株31株進(jìn)行HA和NA基因測(cè)序并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖3)，進(jìn)化分析顯示:22株Yamagata系乙型流感病毒HA基因均屬于Yamagata Clade 3分支，其中 20株與 B/Phuket/3073/2013疫苗株屬于共同的亞支，而 B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和B/Anhui-Yingzhou/11264/2017兩株病毒HA基因?qū)儆诹硪粊喼?，還有一個(gè)亞支為B/Wisconsin/01/2010類似株；9株Victoria系乙型流感病毒HA基因均屬于Victoria Clade1A分支，其中以 B/Hong Kong/286/2017和 B/Norway/2409/2017為代表的最新進(jìn)化亞支 Clade1A(Δ1、Δ2)中未發(fā)現(xiàn)安徽省流行株。

根據(jù)上述31株乙型流感毒株NA基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和 B/Anhui-Yingzhou/11264/2 017兩株Yamagata系病毒的NA基因?qū)儆赩ictoria系，與疫苗株B/Malaysia/2506/2004的NA基因親緣關(guān)系較近，因此這兩株Yamagata系病毒為BY-HA/BV-NA系間重配病毒。

所有22株Yamagata系乙型流感病毒HA基因和B/Phuket/3073/2013疫苗株相比，均有D196 N突變，除B/Anhui-Yingzhou/11238/2017和B/Anhui-Yingzhou/11264/2 017兩株病毒以外，其他20株病毒HA基因均攜帶 L172Q和 M251V突變；9株Victoria系乙型流感病毒HA基因與B/Brisbane/60/2008疫苗株對(duì)比，均有I117V和N129D突變。根據(jù)NA基因序列對(duì)神經(jīng)氨酸酶活性位點(diǎn)進(jìn)行分析，安徽省流行的乙型流感病毒未發(fā)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)氨酸酶敏感性降低的分子突變。

3 討論

乙型流感病毒兩個(gè)譜系在某個(gè)區(qū)域的交叉循環(huán)流行幾乎是不可預(yù)測(cè)的，從而導(dǎo)致WHO目前推薦的三價(jià)流感疫苗和當(dāng)?shù)亓餍械囊倚土鞲凶V系不匹配也常有發(fā)生[13]。2015—2016年度安徽省主要以Victoria系乙型流感病毒為主要流行株，而Yamagata系為疫苗候選株；2016—2017、2017—2018年度均以Victoria系為疫苗株，但2017年7月份以后，安徽省Yamagata系乙型流感呈明顯的優(yōu)勢(shì)流行。因此近3年期間WHO推薦的三價(jià)疫苗株與安徽省流行的乙型流感病毒時(shí)常不匹配，但通過(guò)抗原性分析發(fā)現(xiàn)，2017—2018年度安徽省流行的乙型流感病毒均為WHO推薦疫苗株的類似株。由此可見(jiàn)，除了三價(jià)流感疫苗未完全覆蓋安徽省所有流感型別外，疫苗接種率低也有可能是造成該年度Yamagata系乙型流感優(yōu)勢(shì)流行的重要原因之一。

盡管該年度安徽省流行的乙型流感病毒的HA基因均處于Yamagata系clade 3和Victoria系clade 1 A分支中，但均在分支出現(xiàn)了亞支，可能與宿主適應(yīng)性選擇相關(guān)，但安徽省Victoria系流感病毒未呈現(xiàn)“階梯樣”進(jìn)化特征和Yamagata系復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[14]，可能是因?yàn)檫x取的樣本時(shí)間跨度較短有關(guān)。值得關(guān)注的是，本研究首次發(fā)現(xiàn)安徽省存在BYHA/BV-NA系間重配病毒，且基因重配在乙型流感病毒的流行、進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[15]。方斌等[11]研究發(fā)現(xiàn)，乙型流感發(fā)生系內(nèi)重配和系間重配的病毒均會(huì)造成該病毒的大流行，可能因?yàn)榛虻闹嘏鋵?dǎo)致其發(fā)生抗原轉(zhuǎn)變。由于人群廣泛缺乏相應(yīng)的免疫保護(hù)屏障，因而會(huì)引發(fā)乙型流感的暴發(fā)或流行[16]。安徽省發(fā)現(xiàn)的Yamagata系間重配病毒為2017年12月份分離，此時(shí)正值該系病毒流行峰值。盡管乙型流感病毒的點(diǎn)突變速率小于甲型流感病毒，但由于頻繁地發(fā)生系內(nèi)或系間重配，為病毒逃逸宿主既存的獲得性免疫應(yīng)答創(chuàng)造有利條件，使其可以長(zhǎng)期在人群中流行[17]，因此應(yīng)密切關(guān)注該病毒的分子變異。

將WHO推薦的2017—2018年度疫苗株 B/Brisbane/60/2008和 B/Phuket/3073/2013，與該年度安徽省乙型流感病毒分別比對(duì)它們的氨基酸序列，在重要的HA抗原表位190-helix(194～202)、160-loop(162～167)及150-loop(141～150)與120-loop(116～137)之中，有22株Yamagata系病毒的D196 N突變發(fā)生在190-helix抗原表位，該位點(diǎn)具有很強(qiáng)的抗原性[18]；9株Victoria系病毒的I117 V和N129D突變發(fā)生在120-loop抗原表位，該表位是突變最為頻繁的區(qū)域，而129位點(diǎn)的突變可引起抗原變化[11，19]。

本文通過(guò)對(duì)安徽省2017—2018年度乙型流感病毒流行病學(xué)和基因特征進(jìn)行分析，初步掌握了該病原在安徽省的基本情況，但仍需進(jìn)一步分析該病原在人和動(dòng)物間的流行近況，以及病毒進(jìn)化特征和致病機(jī)理，從而制定合理的疫苗免疫接種策略進(jìn)行科學(xué)防控。

利益沖突 無(wú)