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羊瘙癢因子263K感染倉鼠腦組織中蘭尼堿受體2表達(dá)變化的研究

2018-11-14 11:34李堯黎建樂肖康馬月高麗萍王晶甄禎郭燕軍石琦
關(guān)鍵詞:組織化學(xué)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)倉鼠

李堯 黎建樂 肖康 馬月 高麗萍 王晶 甄禎 郭燕軍 石琦

100050北京,首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(李堯、黎建樂、甄禎、郭燕軍);102206北京,中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所朊病毒室(肖康、馬月、高麗萍、王晶、石琦)

朊病毒病是一種可侵襲人及動物神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病,致死率100%,目前尚無有效治療措施。根據(jù)目前流行的朊病毒病發(fā)病機(jī)制學(xué)說,神經(jīng)系統(tǒng)中正常存在的朊蛋白(prion cellular protein,PrPc)錯誤折疊后形成具蛋白酶抗性的異常朊蛋白(scrapie isoform of prion protein,PrPSc),在神經(jīng)系統(tǒng)沉積并導(dǎo)致神經(jīng)元退行性變[1]。人類的朊病毒病包括人克雅氏病、庫魯病、致死性家族失眠癥等。動物朊病毒病包括羊瘙癢病(scrapie)、牛的海綿狀腦病(bovine pongiform encephalopathy,BSE)及麋鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease,CWD)等。朊病毒病典型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變包括淀粉樣斑塊沉積、神經(jīng)元細(xì)胞丟失、膠質(zhì)細(xì)胞增生和海綿樣空泡變性。

鈣離子是一種重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使。鈣離子穩(wěn)態(tài)對于維持細(xì)胞的正常形態(tài)和功能具有重要意義[2]。細(xì)胞胞漿內(nèi)的鈣離子主要來源于兩個方面,分別為胞外鈣離子內(nèi)流和胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或肌漿網(wǎng)內(nèi)的鈣庫。蘭尼堿受體(ryanodine receptors,RyRs)作為一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)的鈣離子通道,他的開放可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或肌漿網(wǎng)中的鈣離子進(jìn)入胞漿內(nèi),參與維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的平衡。

RyR2是蘭尼堿受體家族的代表成員,不僅維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)定,并在神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育和凋亡中起重大作用。研究發(fā)現(xiàn),RyR2參與到阿爾茲海默病等變性疾病的發(fā)病過程,與異常蛋白如Aβ淀粉樣蛋白的沉積關(guān)系密切。但對于RyR2與朊病毒病相互關(guān)系的研究甚少,RyR2在朊病毒感染人及哺乳動物中的表達(dá)變化尚未明確。本課題組在前期研究中應(yīng)用2D-DIGE差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法發(fā)現(xiàn),在遺傳性朊病毒病腦組織中,RyR2表達(dá)明顯上調(diào),提示RyR2可能與朊病毒感染相關(guān),為探索RyR2與朊病毒病之間的相互關(guān)系提供理論線索[3]。

本研究利用羊瘙癢因子倉鼠敏感株263 K感染的倉鼠為動物模型,通過免疫印跡方法探索RyR2在263 K感染倉鼠腦組織中表達(dá)水平的變化。通過免疫組織化學(xué)染色,明確了RyR2在朊病毒感染病變組織中的表達(dá)分布,并初步分析了RyR2與朊蛋白PrP的共定位關(guān)系,為進(jìn)一步探討和揭示RyR2在朊病毒病發(fā)病過程中的作用和分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 腦組織勻漿制備 羊瘙癢因子263 K感染的黃金倉鼠終末期(感染后第80 d)腦組織樣品保存于-70℃冰箱,使用時分別用裂解液(10 mmol/L NaCI,10 mmol/L EDTA,0.5%NP 40,0.5%Sodium deoxycholate,10 mmol/L,Tris,pH7.4)制成10%(wt/vol)腦勻漿,2 000 g離心10 min去除組織碎片,取上清,置于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 Western blot檢測 取15μg腦組織勻漿樣本經(jīng)SDS上樣緩沖液處理后進(jìn)行8%SDS-PAGE,電轉(zhuǎn)至NC膜上,檢測RyR2蛋白的電轉(zhuǎn)移使用槽式濕轉(zhuǎn),將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中,以200 V穩(wěn)壓電轉(zhuǎn)3.5 h。檢測β-actin使用半干式電轉(zhuǎn)移,以160 mA穩(wěn)流電轉(zhuǎn)1.5 h。轉(zhuǎn)膜成功后以5%脫脂奶封閉1 h,一抗孵育,4℃過夜后以PBS浸泡5 min×3次,以二抗室溫孵育2 h,ECL顯色。反應(yīng)條帶用軟件Image J測定灰度值進(jìn)行定量分析。所用抗體及稀釋比例如下:RyR2兔源多克隆一抗(Abcam,1∶5 000稀釋)、β-actin 鼠源單克隆一抗(Santa,1∶5 000 稀釋);二抗為HRP標(biāo)記的抗鼠及抗兔IgG抗體(Santa,1∶5 000稀釋)。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 腦組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水后,復(fù)合消化酶處理2 min,PBS浸泡2 min,微波抗原修復(fù)30 min,復(fù)溫后PBS浸泡2 min,3%過氧化氫處理15 min,PBS浸泡3 min×3次,5%BSA室溫封閉1 h,RyR2一抗孵育4℃過夜,PBS浸泡5 min×3次;加入二抗,37℃孵育0.5 h,PBS洗5 min,3次,DAB顯色,蘇木素復(fù)染、透明及封片,顯微鏡下拍攝照片。利用Image Pro Plus 6.0軟件對免疫組織化學(xué)圖片測定灰度值,進(jìn)行定量分析。所用抗體及稀釋比例如下:RyR2兔源一抗(Abcam,1∶200稀釋);二抗為生物素標(biāo)記羊抗兔IgG試劑盒(中衫金橋)。

1.4 免疫熒光雙標(biāo)染色 腦組織切片處理同常規(guī)免疫組化方法,5%BSA室溫封閉1 h后,加入RyR2特異性兔源多克隆抗體與PrP特異性鼠源單克隆抗體3F4的混合一抗,4℃孵育過夜后,PBS浸泡5 min×5次;加入 AlexaFlour 546標(biāo)記的羊抗兔與AlexaFlour 488標(biāo)記的羊抗鼠混合二抗,37℃孵育2 h,PBS浸泡5 min×5次,室溫避光下DAPI染色20 min,PBS浸泡5 min×5次。抗熒光衰減封片劑封片,Operetta CLS高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)下觀察。所用抗體及稀釋比例如下:RyR2兔源一抗(Abcam,1∶200 稀釋)、3F4 鼠源一抗(Santa,1∶250 稀釋);AlexaFlour 546標(biāo)記的羊抗兔二抗(Invitrogen,1∶200稀釋)、AlexaFlour 488標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Invitrogen,1∶200 稀釋)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,兩組間差異比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RyR2在朊病毒感染腦組織各腦區(qū)的表達(dá)為了探究RyR2在朊病毒感染腦組織中的分布和定位,本研究選取了正常倉鼠及羊瘙癢因子263 K感染倉鼠終末期(感染后第80 d)腦組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果顯示,RyR2在正常及263 K感染倉鼠腦組織中均有分布,兩者分布區(qū)域大致相同,主要分布定位于小腦浦肯野細(xì)胞層及大腦皮層,在海馬、下丘腦和嗅球也有分布。其中在正常倉鼠的各腦區(qū)中,與感染倉鼠相比,可以發(fā)現(xiàn)RyR2染色增強(qiáng)、陽性細(xì)胞數(shù)增多(圖1)。利用Image Pro Plus 6.0軟件對圖片測定灰度值,進(jìn)行熒光強(qiáng)度定量分析,結(jié)果顯示,263 K感染倉鼠各腦區(qū)RyR2表達(dá)均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.2 朊病毒感染倉鼠模型中RyR2表達(dá)降低 為了探究在朊病毒感染動物模型中RyR2表達(dá)的變化,本研究選取正常倉鼠及羊瘙癢因子263 K感染終末期倉鼠(感染后第80 d)為研究對象,利用Western blot檢測 RyR2表達(dá)含量的變化。以 βactin為內(nèi)參進(jìn)行相對定量,使用Image J對目的蛋白條帶進(jìn)行灰度定量分析,結(jié)果利用t檢驗(yàn)分析,結(jié)果顯示,在263 K感染倉鼠腦組織中,RyR2的表達(dá)均較正常對照組明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037)(圖3)。

2.3 RyR2與朊蛋白存在共定位關(guān)系 為了探究RyR2與朊蛋白(PrP)是否存在共定位關(guān)系,本研究選取了正常倉鼠及羊瘙癢因子263 K感染倉鼠終末期(感染后第80 d)腦組織切片進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)染色。結(jié)果提示,在正常及263 K感染倉鼠腦組織切片的大腦皮層中,均發(fā)現(xiàn)了RyR2與PrP蛋白存在共定位關(guān)系(圖4)。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測朊病毒263 K毒株感染倉鼠及正常倉鼠腦組織中RyR2表達(dá)(×400)Fig.1 Immunohistochemical detection of RyR2 in scrapie-263 K infected and normal hamster brain tissue(×400)

3 討論

RyR家族共有3種亞型:RyR1-3。在外周組織中,RyR1主要分布在骨骼??;RYR2主要分布在心臟平滑??;RyR3主要分布在一些上皮細(xì)胞、胃組織細(xì)胞及全身其他器官。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)當(dāng)中,3種亞型均有表達(dá),其中 RyR2的表達(dá)最為豐富。RyR2主要分布于神經(jīng)元細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,由同源四聚體組成,每個單體相對分子質(zhì)量約為550×103。目前已有多種物質(zhì)被證實(shí)與RyR2的活性有關(guān),如FKBP、鈣離子、鈣調(diào)蛋白(CaM)、蛋白激酶 A(PKA)等[4]。

RyR2在神經(jīng)元的樹突、胞體、突觸中均有分布[5]。在此前的文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn),哺乳動物中,RyR2主要分布在大腦皮層和小腦浦肯野細(xì)胞層,并在海馬、丘腦等部位也有表達(dá)。除此之外,在嗅球、視神經(jīng)、腦干等均發(fā)現(xiàn)RyR2的分布[6]。本研究利用免疫組織化學(xué)的方法探索RyR2在倉鼠腦組織中的分布,發(fā)現(xiàn)在正常和感染倉鼠的腦組織中,在大腦皮層、小腦、海馬、嗅球、下丘腦均發(fā)現(xiàn)RyR2的表達(dá),這與此前文獻(xiàn)的報(bào)道基本符合。

圖3 朊病毒263 K毒株感染倉鼠腦組織中RyR2表達(dá)含量與正常倉鼠比較Fig.3 RyR2 expression in the brain of scrapie-263 K infected was decreased compared with normal hamster

圖4 免疫組織熒光檢測顯示,感染倉鼠終末期腦組織中RyR2與PrP存在共定位關(guān)系(×400)Fig.4 Co-localization between RyR2 and PrP in scrapie-263 K infected and normal hamster brain tissue(×400)

RyR2參與到記憶以及學(xué)習(xí)的形成過程,可以將不穩(wěn)定的記憶整合成強(qiáng)大、持久的記憶痕跡。受過水迷宮訓(xùn)練的大鼠,可以發(fā)現(xiàn)其海馬中RyR2表達(dá)增高[7]。給小鼠腦室內(nèi)注射RyR2拮抗劑,可以發(fā)現(xiàn)小鼠的記憶能力較對照組下降[8]。其次,RyR家族還與藥物成癮、社交活動、情緒變化等癥狀表現(xiàn)關(guān)系密切[9-11],這些都體現(xiàn)了RyR2在高級皮層功能方面的重要作用。因此,在正常生理狀態(tài)情況下,大腦中RyR2的存在對于認(rèn)知功能的形成有重要作用,RyR2的表達(dá)減少或者功能抑制會導(dǎo)致記憶力的損害。而快速進(jìn)展的認(rèn)知功能下降正是人類朊病毒病最常見的癥狀之一。本研究發(fā)現(xiàn),RyR2的表達(dá)在朊病毒感染動物模型中明顯下降,提示其可能與認(rèn)知功能的快速下降有關(guān)。

除此之外,RyR2與神經(jīng)變性疾病也有密切的聯(lián)系。大部分研究都認(rèn)為在阿爾茲海默病中,RyR2的表達(dá)較正常上升。Bruno等發(fā)現(xiàn),在輕度認(rèn)知障礙和阿爾茲海默病(Alzheimer disease,AD)患者的額葉腦組織中,都發(fā)現(xiàn)了RyR2的mRNA表達(dá)量的升高[12],提示RyR2可能在認(rèn)知功能障礙的早期即參與到疾病發(fā)展的過程中。Liang還發(fā)現(xiàn),在AD模型小鼠中,接受RyR拮抗劑丹曲林處理的小鼠,其認(rèn)知功能較對照組明顯改善,海馬區(qū)的老年斑形成也相對減少[14]。但也有少量研究得出了與之相悖的結(jié)果。Kelliher等[15]發(fā)現(xiàn),在早期AD患者的腦組織中,RyR2的表達(dá)量明顯減少。Andrea等則發(fā)現(xiàn),在Aβ處理誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞株中,RyR2的表達(dá)減少[16]。在前期工作中發(fā)現(xiàn)RyR2在人遺傳性朊病毒病腦組織中表達(dá)明顯上調(diào)。而在263 K感染倉鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)了相反的變化趨勢,這說明RyR2在人和其他哺乳動物中可能發(fā)揮著不一樣的功能;其次,這也說明仍需要更多的研究嘗試,從不同的角度驗(yàn)證RyR2在朊病毒病中的表達(dá)變化。有趣的是,在心血管疾病中的研究領(lǐng)域中,不同學(xué)者對RyR2的研究也出現(xiàn)了這種互相矛盾的現(xiàn)象[16]。除此之外,在帕金森病、亨廷頓疾病、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)等遺傳相關(guān)的神經(jīng)變性病中,也發(fā)現(xiàn)了RyR2表達(dá)或者鈣離子代謝紊亂的問題[17-18]。

雖然RyR2在不同神經(jīng)變性疾病中的表達(dá)變化有所爭議,但普遍認(rèn)為,RyR2介導(dǎo)了淀粉樣蛋白對神經(jīng)元細(xì)胞的損傷過程。學(xué)者們猜測,可能是包括Aβ、PrP在內(nèi)的淀粉樣蛋白通過刺激神經(jīng)元細(xì)胞,造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)RyR2功能的紊亂,大量鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)流入胞漿內(nèi),破壞神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài),進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[15]。因此,在朊病毒感染倉鼠模型中,RyR2的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的下降,其中的原因可能與PrPSc大量復(fù)制后影響RyR2的功能有關(guān)。除此之外,朊病毒病感染動物終末期的腦組織中,神經(jīng)元的大量丟失也可能是導(dǎo)致RyR2表達(dá)含量下降的重要原因之一。

RyR2對于高級皮層功能的發(fā)育和完善有重要的作用,并介導(dǎo)參與了神經(jīng)退行性病變的過程,RyR2的功能紊亂或者表達(dá)異常會影響神經(jīng)細(xì)胞功能,甚至導(dǎo)致其凋亡。雖然目前已有學(xué)者探索RyR2作為靶點(diǎn)用于治療阿爾茲海默病,但考慮到RyR2在兩類疾病中這種截然相反的變化趨勢,提示應(yīng)用RyR2拮抗劑治療朊病毒病的研究方向中,可能需要針對不同型別進(jìn)行精準(zhǔn)研究。這種差異對研究RyR2與朊病毒病的相互關(guān)系起到了重要的參考作用。

利益沖突 無

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