易立 曲媛 郭芳 湯劼 魏田力

100050北京,首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(易立、曲媛、郭芳),兒科(魏田力);100050北京,首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科(湯劼)

隨著社會老齡化的加速，心腦血管病已成為嚴重威脅人類健康的重大疾病，其最主要的病變基礎是動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)。血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)涉及到AS病變發(fā)生、發(fā)展的全部過程。VSMC由收縮表型轉(zhuǎn)化為合成表型的過程稱之為表型轉(zhuǎn)化。VSMC表型轉(zhuǎn)化是易損斑塊、支架術后再狹窄和動脈粥樣硬化等血管性病變發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵性步驟[1]。

巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)屬于皰疹病毒科β亞科，是一種廣泛存在于自然界的機會致病性病毒。既往研究證實CMV所致的慢性潛伏性感染與動脈粥樣硬化的形成發(fā)展密切相關[2]。原發(fā)性CMV感染首先累及內(nèi)皮細胞，隨后在VSMC內(nèi)潛伏或持續(xù)性感染，導致VSMC的肥大、增殖和遷移，對AS的形成及狹窄起重要作用[3]，但CMV感染是否參與VSMC表型轉(zhuǎn)化的過程目前尚未明確。

PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化的主要信號通路[4]，有文獻報道，其下游轉(zhuǎn)錄激活因子FoxO通過與促血管平滑肌細胞分化因子Myocardin的協(xié)同作用來調(diào)控表型轉(zhuǎn)化標志基因的表達。

本實驗以平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)和骨橋蛋白(osteopontin，OPN)分別作為VSMC收縮型和合成型的標志基因，旨在通過體內(nèi)和體外實驗證實CMV是否參與VSMC的表型轉(zhuǎn)化過程，以及其可能的作用途徑和機制。

1 材料與方法

1.1 制備小鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV) 感染致動脈粥樣硬化的apoE-/-小鼠模型MCMV Smith株購自美國典型生物收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，通過空斑形成實驗確定小鼠巨細胞的滴度為2×105PFU。8周齡雄性apoE-/-小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2014-0004，SPF級環(huán)境，高脂飼料喂食(購自北京科澳飼料有限公司，21%豬油，1.2%膽固醇，0.2%膽酸鈉)。適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。將動物隨機分為感染組和正常對照組，每組12只，感染組予2×105PFU MCMV 200μl腹腔注射，對照組予等量的DMEM腹腔注射。分別于實驗第8、12、16周從兩組各隨機選取1只小鼠，通過超高分辨率小動物彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)(MS-550高頻寬帶電子線陣探頭，頻率40 MHz)判斷小鼠主動脈粥樣硬化斑塊形成情況，決定取材時間。

1.2 apoE-/-小鼠主動脈取材、HE染色及免疫組化檢測 ApoE-/-小鼠禁食水8 h后稱重，取血。麻醉后取腹側正中線切口，暴露主動脈及其分支。切取主動脈起始至左鎖骨下動脈開口段，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件采集apoE-/-小鼠主動脈動脈粥樣硬化斑塊面積、管腔面積。每個指標選取4個不同切面，取平均值進行統(tǒng)計。免疫組化檢測各組小鼠主動脈斑塊中平滑肌表型轉(zhuǎn)化的標志蛋白SM22a和OPN的表達。

1.3 小鼠主動脈血管平滑肌細胞(MOVAS)的培養(yǎng) MOVAS細胞購自美國ATCC，用含10%PBS的細胞培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合至70% ～80%，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，按1∶4傳代，選取第3～5代進行實驗。MOVAS細胞分為兩組，實驗組將MCMV與MOVAS共同孵育，對照組加入等量的DMEM，24 h后收集細胞進行實驗。

1.4 小鼠主動脈血管平滑肌細胞(MOVAS)表型轉(zhuǎn)化相關指標的檢測 應用不同滴度MCMV刺激MOVAS細胞，MTT法檢測不同時間點各滴度MCMV對MOVAS細胞增殖的影響。選取MOVAS細胞增殖最明顯的MCMV滴度作為實驗組，并以正常MOVAS細胞作為對照組。應用Western blot檢測兩組細胞表型轉(zhuǎn)化標志蛋白SM22a和OPN的表達。

1.5 MCMV對MOVAS表型轉(zhuǎn)化PI3K/Akt通路的作用 應用Western blot分別檢測對照組和實驗組PI3K/Akt通路中的Akt、磷酸化的Akt表達水平。給予特異性的PI3K通路的抑制劑Ly294002后，應用Western blot檢測兩組平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化標志蛋白SM22a和OPN的表達情況。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 apoE-/-小鼠主動脈HE染色及免疫組化結果實驗第16周，小動物超聲檢查顯示感染組主動脈壁內(nèi)膜增厚，連續(xù)性中斷，并可見動脈粥樣硬化斑塊形成，斑塊內(nèi)回聲略高于內(nèi)膜。對照組未見明顯斑塊形成。因此，本研究選擇飼養(yǎng)16周時進行主動脈取材。apoE-/-小鼠主動脈HE染色觀察脂質(zhì)斑塊發(fā)現(xiàn)，對照組和感染組小鼠16周時動脈斑塊面積分別為(3.16±0.72)%和(28.71±3.07)%，感染組的動脈粥樣硬化斑塊的程度較正常飲食組嚴重(P=0.007，圖1)，且二者相比差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 飼養(yǎng)16周時正常組和感染組apoE-/-小鼠主動脈HE染色(×40)Fig.1 HE staining of aorta in control and infection group of apoE-/-mice after 16 weeks of feeding(×40)

免疫組化染色結果顯示，對照組的10個主動脈中有9個SM22a染色陽性，SM22a陽性染色顆粒主要位于血管壁富含平滑肌細胞的中膜和外膜，而OPN染色陽性的主動脈則只有1個。CMV感染組的結果與對照組相反，10個主動脈中2個SM22a染色陽性，而OPN染色陽性的主動脈則多達10個，OPN陽性染色顆粒主要位于血管壁的中膜、外膜以及粥樣硬化斑塊中(圖2、3)。在未出現(xiàn)明顯動脈粥樣硬化斑塊的對照組中，動脈壁以表達收縮期蛋白為主；在MCMV感染組，動脈粥樣硬化程度加重，動脈壁中高表達的收縮期蛋白被合成期的蛋白所取代，說明MCMV感染促使動脈粥樣硬化進展的同時，誘導了平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)化。

2.2 MCMV感染對MOVAS表型轉(zhuǎn)化指標的影響 觀察不同滴度及時間下MCMV對MOVAS細胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)在24 h誘導3×104PFU滴度的MCMV誘導細胞增殖最明顯(表1)。

圖2 正常組(×100)和感染組apoE-/-小鼠主動脈SM22a免疫組化染色(×40)Fig.2 SM22a immunohistochemical staining of aorta in normal group(×100)and infection group of apoE-/-mice(×40)

圖3 正常組和感染組apoE-/-小鼠主動脈OPN免疫組化染色(×100)Fig.3 OPN immunohistochemical staining of aorta in normal group and infection group of apoE-/-mice(×100)

表1 不同滴度MCMV誘導MOVAS細胞增殖情況Tab.1 The proliferation of MOVAScells induced by different titers of MCMV

Western blot結果顯示，3×104PFU MCMV感染MOVAS 24 h細胞后，SM22a表達較對照組下降，OPN表達較對照組增加，且兩組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.023，P=0.034，圖4、5)。

2.3 MCMV對MOVAS表型轉(zhuǎn)化PI3K/Akt通路的調(diào)控 為明確PI3K/Akt通路在MCMV促平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化中的作用，本研究檢測了磷酸化的Akt蛋白的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)MCMV明顯刺激磷酸化Akt蛋白表達上調(diào)(P=0.035)。本研究預先用PI3K的抑制劑Ly294002(10-6mol/L)孵育MOVAS 30 min后，用3×104PFU滴度的MCMV刺激24 h，LY294002可阻斷MCMV感染后的Akt蛋白磷酸化(P=0.031)，而對對照組無明顯影響(P=0.081，圖6)，提示MCMV促平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化可能經(jīng)由PI3K/Akt信號通路介導。

圖4 SM22a蛋白在對照組和實驗組的表達Fig.4 Expression of SM22a protein in the control group and the experimental group

圖5 OPN蛋白在對照組和實驗組的表達Fig.5 Expression of OPN protein in control group and experimental group

圖6 LY294002預處理前后，對照組和感染組磷酸化的Akt蛋白表達1 control group， 2 MCMV infection group， 3 control+LY294002，4 MCMV+LY294002 ?compared with the control group(P＜0.05)，?? compared with the MCMV group(P＜0.05)Fig.6 Expression of phosphorylated Akt protein in control group and infection group before and after LY294002 pretreatment

圖7 顯示單獨 LY294002對MOVAS表型轉(zhuǎn)化收縮期標志蛋白SM22a的表達無影響，但MCMV+LY294002組的SM22a蛋白表達較MCMV組明顯上調(diào)，且與對照組相比統(tǒng)計學差異消失。說明LY294002可明顯抑制MCMV促平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的作用，進一步提示PI3K/Akt信號途徑可能參與了MCMV促平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的過程。

圖7 LY294002預處理前后，對照組和感染組MOVAS細胞中SM22a蛋白的表達1 control group， 2 MCMV infection group， 3 control+LY294002，4 MCMV+LY294002 ?compared with the control group(P＜0.05)Fig.7 Expression of SM22a protein in MOVAS cells of control group and infection group before and after LY294002 pretreatment

3 討論

VSMCs的表型決定了細胞的生物學特性和功能[5]。正常VSMCs是收縮型，VSMCs表型由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化是其增生的先決條件。生理情況下，VSMC處于非增殖狀態(tài)，表現(xiàn)為分化良好的收縮表型。血管損傷后，VSMC轉(zhuǎn)化為增殖性的合成表型，合成和分泌多種血管活性物質(zhì)；同時自身發(fā)生肥大，增殖和遷移，導致管壁增厚、管腔狹窄。SM22α是一個22×103的細胞骨架蛋白，其功能涉及血管平滑肌細胞的收縮調(diào)節(jié)，被認為是收縮表型的標志物之一。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是細胞外基質(zhì)中一種富含唾液酸的磷酸化糖蛋白，最早從骨基質(zhì)分離，是合成型細胞的標記基因，它的出現(xiàn)代表血管平滑肌細胞進入了合成型，具有了活躍的增殖與遷移能力。電鏡下，典型的收縮表型和合成表型的VSMCs應具有明顯的形態(tài)、結構區(qū)別。前者核小、染色質(zhì)致密，胞漿富含收縮蛋白、肌絲，而較少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復合體等合成、分泌性細胞器。而后者則核大、染色質(zhì)疏松，少肌絲，但卻富含合成、分泌性細胞器。

CMV感染首先累及內(nèi)皮細胞，隨后在VSMC內(nèi)潛伏或持續(xù)性感染，導致VSMC的肥大、增殖和遷移[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在CMV所致的apoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中，收縮表型標志蛋白SM22α較對照組表達明顯減少，而合成表型標志蛋白OPN的表達則明顯增加。細胞學實驗結果與之相符，說明CMV感染可以促進平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化。

VSMC表型轉(zhuǎn)化受多重因素的調(diào)控，PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)化的主要信號通路。在本實驗中，PI3K/Akt信號通路的阻斷劑LY294002可以顯著阻斷MCMV感染誘導的SM22a蛋白表達的下調(diào)，以及Akt蛋白的磷酸化，而對照組無明顯變化。有文獻報道，PI3K/Akt信號通路的下游產(chǎn)物FoxO通過與促VSMC表型轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄激活因子Myocardin的協(xié)同作用來調(diào)控表型轉(zhuǎn)化標志基因的表達[7]。之前的研究發(fā)現(xiàn)CMV通過編碼miR-217下調(diào)FoxO3a蛋白的表達，使血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移能力明顯增強[8]。近期的研究還發(fā)現(xiàn)，Myocardin的轉(zhuǎn)錄活性能被 CMV所增強，促使VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化[9]，這也為進一步探討CMV誘導的平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化的作用機制提供了思路。

總之，CMV感染可以促使平滑肌細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，PI3K/Akt信號通路是其作用途徑，但其詳細的作用機制，目前還遠未明確。

利益沖突 無