徐 磊，劉 佳，徐一凡，沈立承，江崢增，王 鑫，宿杰·阿克蘇，徐 晨，侯英勇，黃 潔

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科，上海 200032

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，最常見的病理類型為腺癌。以手術(shù)切除、化學(xué)藥物治療和放射治療為主的綜合治療能有效提高結(jié)直腸癌患者的5年生存率[1-3]。近年來，結(jié)直腸癌的分子靶向治療迅速發(fā)展，分子靶向藥物的聯(lián)合應(yīng)用明顯延長了晚期結(jié)直腸癌患者的生存時間[4-6]。目前應(yīng)用于結(jié)直腸癌的分子靶向藥主要為以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)為靶點的單克隆抗體，如西妥昔單抗和帕尼單抗。研究[4-8]發(fā)現(xiàn)，發(fā)生鼠類肉瘤濾過性病毒致癌基因同源體B1(BRAF)基因突變的患者均對EGFR單克隆抗體耐藥。而BRAF基因是結(jié)直腸癌治療的重要靶點。本研究回顧性分析了近年來本院收治的結(jié)直腸癌BRAF基因突變患者的BRAF基因檢測及突變情況，并探討了BRAF基因突變與臨床病理的關(guān)系，進而探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科2008年1月至2013年12月接受BRAF基因檢測且檢測結(jié)果為陽性的結(jié)直腸癌患者17例。其中，男性7例，女性10例；年齡28～74歲，中位年齡47歲，平均年齡48歲。所有標(biāo)本均為石蠟包埋標(biāo)本，其中手術(shù)切除標(biāo)本15例，活檢標(biāo)本2例；所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實為結(jié)直腸腺癌。腫瘤組織學(xué)分級2級4例，3級13例；臨床分期為Ⅱ期1例，Ⅲ期5例，Ⅳ期11例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 BRAF基因測序及分析 結(jié)直腸癌組織石蠟包埋，按5 μm厚切片，貼在干凈載玻片上，烤片，蘇木精-伊紅(H-E)染色，刮除非腫瘤組織和出血壞死較明顯的區(qū)域，收集腫瘤組織，提取腫瘤組織基因組DNA。

將提取的基因組DNA用PCR擴增法擴增BRAF基因11、15外顯子。11外顯子引物序列為：5′-TTT TCT GTT TGG CTT GAC TTG A-3′(F)，5′- TGT CAC AAT GTC ACC ACA TTA CA-3′(R)；擴增片段為192 bp。15外顯子引物序列為：5′- TGC TTG CTC TGA TAG GAA AAT G-3′(F)，5′- AGC ATC TCA GGG CCA AAA AT-3′(R)；擴增片段為228 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上游引物2 μL(50 pmol)，下游引物2 μL(50 pmol)，模板3～5 μL(1 mg/L)，去離子水補足50 μL。反應(yīng)條件：94℃ 45 s，62℃ 45 s，72℃ 1 min，36個循環(huán)；72℃延伸10 min。

取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化(純化試劑盒，Axygen)及測序反應(yīng)( BigDye v3.0試劑盒，ABI)后，用3730XL型測序儀(ABI)測序。所有標(biāo)本均經(jīng)正向及反向測序。用Chromas軟件分析測序圖譜，與基因庫BRAF基因序列對比。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以n(%)表示，計量資料組間比較采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 BRAF基因突變 結(jié)果(圖1、表1)顯示：17例BRAF基因突變結(jié)直腸癌病例中，16例為15外顯子突變，1例為11外顯子突變。突變主要位于15外顯子第600位密碼子，共14例(82.4%，14/17)，占15外顯子突變的87.5%，包括第1 799位堿基T突變?yōu)锳(Val600Glu，V600E)13例(92.9%，13/15)，第1 799、1 800位堿基T、G突變?yōu)锳、A(Val600Glu，V600E)1例。2例突變位于15外顯子第594位密碼子(11.8%，2/17)，第1 780位堿基G突變?yōu)锳(Asp594Asn，D594N)。1例11外顯子突變位于第468位密碼子(5.9%，1/17)，第1 403位堿基G突變?yōu)镃(Gly468Val，G468V)。

圖1 BRAF基因15外顯子突變

A：第1 799位堿基T突變?yōu)锳；B: 第1 780位堿基G突變?yōu)锳

表1 患者臨床病理特征及BRAF基因突變類型

2.2 BRAF基因突變與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性 結(jié)果(表2)顯示：BRAF基因突變與患者性別、年齡無相關(guān)性。組織學(xué)分級為3級的BRAF基因突變患者數(shù)多于2級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029)；臨床分期為Ⅳ期的BRAF基因突變患者數(shù)多于Ⅱ期、Ⅲ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.011)。

表2 BRAF基因突變與患者臨床病理特征的相關(guān)性 N=17

3 討 論

BRAF基因位于人類染色體7q34，長度約為190 kb，其編碼區(qū)可編碼相對分子量為67 000～99 000的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。該酶是Ras/Raf/MEK/ERK信號通路中重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過與細胞表面受體結(jié)合，將信號傳遞至細胞核內(nèi)后，激活細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、禽類髓細胞病毒MC-29的V-myc細胞同源序列(c-myc)等因子，參與調(diào)控細胞內(nèi)的多種生物學(xué)事件；而當(dāng)Ras/Raf/MEK/ERK通路被異常激活時，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[9-11]。

研究[9,12-13]表明，BRAF基因與K-RAS基因雖然同參與Ras/Raf/MAPK通路，但兩者突變具有相互排他性，BRAF基因能不依賴于K-RAS基因而獨立參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。研究[14]顯示，黑素瘤和結(jié)腸癌患者中BRAF基因突變率分別為66%、15%。該研究顯示，主要有2種突變類型，約89%的突變位于15位外顯子，其中約92%發(fā)生于第1 799 位堿基( T突變?yōu)锳)，導(dǎo)致其所在的第600位密碼子編碼的谷氨酸被纈氨酸取代(V600E)；約10%的突變位于11位外顯子，發(fā)生如G463、G465、G468等位點突變。本研究17例BRAF基因突變的結(jié)直腸癌患者中，BRAF基因突變主要位于15外顯子第600位密碼子(V600E，82.4%)，其中第1 799 位堿基突變(T突變?yōu)锳)占92.9%；此外，還有2例15外顯子第594位密碼子突變(D594N)和1例11外顯子第468密碼子突變(G468V)，與文獻[14]報道相符。

本研究未發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中BRAF基因突變與患者性別、年齡的相關(guān)性，與其他研究結(jié)論[15-16]一致。本研究中，隨著組織學(xué)分級的增加，BRAF基因突變患者人數(shù)增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與Yuen等[16]的研究結(jié)論相符。結(jié)果提示BRAF基因可作為結(jié)直腸癌診斷、治療的指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，臨床分期中Ⅳ期BRAF基因突變患者人數(shù)比Ⅱ期、Ⅲ期多(P<0.05)，可能與BRAF基因突變激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，導(dǎo)致下游信號通路MEK/ERK激活有關(guān)。動物實驗[17]表明，采用特異性MEK激酶抑制劑阻斷該通路，可抑制黑素瘤的肺轉(zhuǎn)移，甚至能使已經(jīng)產(chǎn)生的肺轉(zhuǎn)移灶縮小、消失。ERK活性增加除影響多種惡性腫瘤相關(guān)基因表達外，還影響肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的活性，降低E-鈣黏素表達和增加基質(zhì)金屬蛋白酶( MMP) 分泌[18]，導(dǎo)致腫瘤細胞增殖和侵襲能力升高。

越來越多的研究[19-22]發(fā)現(xiàn)，BRAF突變預(yù)示轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(mCRC)的患者預(yù)后較差。Samowitz等[22]認(rèn)為，BRAF基因V600E突變是結(jié)腸癌患者總生存時間(OS) 強有力的預(yù)后因子，在微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)低或穩(wěn)定的腫瘤患者中更是如此。研究[22]也表明，BRAF基因V600E突變提示結(jié)腸癌患者預(yù)后不良，而且其預(yù)測作用與臨床分期和治療方式無關(guān)。該研究對100余例接受手術(shù)治療的Ⅱ期結(jié)腸癌患者和200余例接受5-氟尿嘧啶輔助化學(xué)治療的Ⅲ期結(jié)腸癌患者進行的生存分析結(jié)果表明，BRAF基因V600E突變是結(jié)腸癌患者總生存時間和癌癥特異性生存時間的獨立預(yù)測因素。因此，BRAF基因可能為結(jié)腸癌的不良預(yù)后預(yù)測因子。

近年來，使用靶向藥物治療結(jié)直腸癌已改善了患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。然而，Roock等[23]的研究表明，西妥昔單抗聯(lián)合化療對BRAF突變患者的有效率明顯低于野生型者(8.3%vs38.0%，P=0.001 2)；而PRIME研究顯示，BRAF基因突變患者不能從帕尼單抗治療中獲益[24]。因此，在對結(jié)直腸癌患者進行EGFR單克隆抗體治療前，應(yīng)進行BRAF基因檢測。

目前，以BRAF信號通路上的關(guān)鍵分子為靶點的抑制劑在黑素瘤患者中取得了良好的療效。2011年，首個針對BRAF基因V600E突變的抑制劑威羅菲尼(vemurafenib, PLX4032)獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，用于治療BRAF基因V600E突變的黑素瘤患者。2015年，小分子MEK抑制劑考比替尼(cobimetinib)獲FDA批準(zhǔn)，該藥可聯(lián)合威羅菲尼用于BRAF V600E或V600K突變陽性、不可切除性或轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的治療。與威羅菲尼+安慰劑組相比，考比替尼與威羅菲尼聯(lián)合治療組疾病惡化或死亡風(fēng)險顯著降低，中位無進展生存期(9.9個月vs6.2個月，P<0.001)顯著延長[25]。然而，在結(jié)直腸癌領(lǐng)域，目前有關(guān)BRAF基因的研究還沒有臨床獲益[26]，說明腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還有待深入研究。

綜上所述，BRAF基因突變與結(jié)直腸腺癌患者臨床病理特征相關(guān)，可能是一項潛在的預(yù)后指標(biāo)。結(jié)直腸癌患者BRAF基因突變情況及EGFR靶向治療仍須進一步的研究，以進一步闡述結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，并為尋找新的治療靶點和藥物提供理論依據(jù)。