李志雄，徐亞歐，林亞秋

（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

藏雞是青藏高原特有的品種資源，主要生活在青藏高原海拔2200～4400 m的半農(nóng)半牧區(qū)，包括西藏的拉薩、昌都、日喀則中南部以及青海、云南、四川的甘孜、阿壩等地區(qū)，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和人工馴化，已形成一個(gè)適應(yīng)高原氣候、覓食能力強(qiáng)、耐粗飼、人工選擇程度很低的原始小型品種[1].藏雞體型小、生長(zhǎng)緩慢，但肉質(zhì)鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，且具有較強(qiáng)的高海拔適應(yīng)性，是發(fā)展高原養(yǎng)雞業(yè)不可替代的品種資源[2].

miRNA是一類內(nèi)源性、長(zhǎng)為18～25個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA[3].由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)約70～90個(gè)核苷酸的miRNA前體（pre-miRNA）剪切加工形成.在轉(zhuǎn)錄后水平能夠與靶基因的特定序列結(jié)合，從而發(fā)揮其對(duì)靶基因的調(diào)控作用[4].研究表明miRNA能夠參與生物體內(nèi)多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞的增值與分化、肌肉與脂肪的發(fā)育及形成、新陳代謝、激素的分泌、免疫應(yīng)答、疾病的發(fā)生和腫瘤的形成[5].

目前對(duì)藏雞的研究，主要集中在高海拔環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)的生理、生化指標(biāo)及分子機(jī)制方面.但對(duì)藏雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育速度方面的研究還較少，尤其是miRNA對(duì)藏雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控.本研究利用Stem-loop RT-PCR法克隆了藏雞肌肉組織中3條新發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育階段差異表達(dá)的miRNA序列，并利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)其可能的靶基因，從而為進(jìn)一步研究這3條miRNA序列在調(diào)控藏雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藏雞及樣品采集

本試驗(yàn)選取成都益生康健農(nóng)業(yè)有限公司藏雞養(yǎng)殖基地的3只150日齡健康母藏雞為試驗(yàn)動(dòng)物，屠宰前禁食12 h，然后通過(guò)放血法屠宰，屠宰后迅速采集肌肉組織.采集的腿肌組織裝入無(wú)RNA酶的凍存管中，迅速置于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室-80℃保存?zhèn)溆?

1.1.2 主要試劑

Trizol購(gòu)自Invitrogen公司（上海），去基因組污染反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）和 pMD-19T載體購(gòu)自 TaKaRa公司（大連），2 ×Taq PCR Master Mix、膠回收試劑盒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司（北京）.

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成

按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取肌肉組織總RNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量后，利用Nano-Drop ND-2000（Agilent）對(duì)RNA的濃度及純度進(jìn)行檢測(cè).利用去基因組污染反轉(zhuǎn)錄試劑盒將得到的RNA去除基因組DNA污染后合成cDNA第一條鏈，-80℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Chen等提出的 Stem-loop RT-PCR[6]的方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室之前小RNA測(cè)序得到的miR-13＿529、miR-20＿1207 和 miR-24＿1302 的序列，分別設(shè)計(jì)帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性反轉(zhuǎn)錄引物和PCR引物（表1）.表中引物均由生工生物工程有限公司（上海）合成.

表1 反轉(zhuǎn)錄和克隆引物Table 1 The primer sequences of the stem-loop RT-PCR experiments

1.2.3 miRNA序列的克隆

以自行設(shè)計(jì)的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性反轉(zhuǎn)錄引物代替反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的通用引物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，去除基因組DNA污染后，合成cDNA的第一條鏈.以肌肉組織cDNA為模板，PCR反應(yīng)體系（15 μL）為 2 × Taq PCR Master Mix 7.5 μL，F(xiàn)orward Primer（10 pmol/ μL） 0.3 μL，Reverse Primer （10 pmol/μL） 0.3 μL，cDNA （50 ng/ μL） 0.5 μL，ddH2O 6.4 μL.PCR 反應(yīng)條件為 95 °C 4 min；94 °C 30 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s，36 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min.

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后，用膠回收試劑盒切膠回收目的條帶，然后連接pMD-19T載體，轉(zhuǎn)化DH5α后篩選陽(yáng)性克隆，送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序.

1.2.4 miRNA序列前體二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

結(jié)合之前小RNA測(cè)序獲得的3條miRNA的前體序列，利用RNAfold[7]軟件對(duì)三條miRNA前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè).

1.2.5 miRNA序列靶基因的預(yù)測(cè)

利用靶基因預(yù)測(cè)軟件 TargetScan[8]、miRDB[9]、DIANA-microT[10]和miRanda[11]4個(gè)在線軟件，預(yù)測(cè)與3條miRNA序列具有靶標(biāo)關(guān)系的基因，對(duì)4個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件得出的結(jié)果做韋恩圖取其交集，獲得較為可信的靶基因[12-13].

2 結(jié)果

2.1 藏雞肌肉組織中3條miRNA序列的克隆

以肌肉組織RNA為模板，利用自行設(shè)計(jì)的帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA的第一條鏈.經(jīng)過(guò)擴(kuò)增獲得藏雞3條新發(fā)現(xiàn)的miRNA序列，分析表明克隆得到miR-13＿529序列23bp，miR-20＿1207序列21bp，miR-24＿1302序列 22bp （圖 1）.結(jié)合小RNA測(cè)序獲得的3條miRNA的前體序列，對(duì)前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，3條miRNA的前體序列長(zhǎng)度均在60 bp左右，并且均具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)（圖2）.

圖1 3條新發(fā)現(xiàn)miRNA序列的測(cè)序圖譜A:miR-13＿529；B:miR-20＿1207；C:miR-24＿1302Fig.1 Sequencing chromatogram of 3 newly discovered miRNAs

圖2 3條新發(fā)現(xiàn)miRNA序列前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)A:miR-13＿529；B:miR-20＿1207；C:miR-24＿1302Fig.2 Secondary structure prediction for precursors of 3 newly discovered miRNAs

2.2 藏雞肌肉組織中3條miRNA序列靶基因的預(yù)測(cè)

利用 TargetScan、miRDB、DIANA-microT 和 mi-Randa在線軟件，預(yù)測(cè)得到與miR-13＿529具有靶標(biāo)關(guān)系的基因分別有53、128、105和509個(gè).做韋恩圖取其交集，結(jié)果如圖3A所示.4個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)出2個(gè)靶基因，分別為 Spermatid perinuclear RNA binding protein（STRBP）基因和 lysine（K）-specific demethylase 2B（KDM2B）基因.與 miR-20＿1207具有靶標(biāo)關(guān)系的基因分別有146、140、168和429個(gè).做韋恩圖取其交集，結(jié)果如圖3B所示.4個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)出10個(gè)靶基因，分別為 Phosphofurin acidic cluster sorting protein 2 （PACS2）基因、H2A histone family，member Z（H2AFZ）基因、Oxysterol binding protein-like 1A（OSBPL1A）基因、Syntabulin （SYBU）基因、Valosin containing protein interacting protein 1（VCPIP1）基因、Member RAS oncogene family 5C （RAB5C）基因、AT rich interactive domain 2 （ARID2）基因、Family with sequence similarity 168，member A （FAM168A）基因、Neuro-oncological ventral antigen 1 （NOVA1）基因和Arginine and glutamate rich 1（ARGLU1）基因 .與miR-24＿1302具有靶標(biāo)關(guān)系的基因分別有21、19、6和31個(gè).做韋恩圖取其交集，結(jié)果如圖3C所示.4個(gè)軟件沒(méi)有預(yù)測(cè)出共同靶基因，miRDB、DIANA-microT和miRanda 3個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)出1個(gè)靶基因，為Overexpressed in colon carcinoma 1 protein homolog （OCC-1）基因.

圖3 TargetScan、miRDB、DIANA-microT和miRanda軟件預(yù)測(cè)的3條新發(fā)現(xiàn)miRNA序列的靶基因的數(shù)量A:miR-13＿529；B:miR-20＿1207；C:miR-24＿1302Fig.3 The amount of target genes predicted by TargetScan，miRDB，DIANA-microT and miRanda for 3 newly discovered miRNAs

3 討論

作為青藏高原特有的原始品種，藏雞肉質(zhì)鮮美，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并以區(qū)別于普通肉雞的半野生生活模式受到市場(chǎng)的青睞，市場(chǎng)價(jià)格較普通肉雞也高出很多.藏雞耐粗飼放養(yǎng)，抗病力強(qiáng)，對(duì)青藏高原的惡劣氣候和生態(tài)環(huán)境有很好的適應(yīng)能力，但是藏雞體型小，生長(zhǎng)緩慢，通常需要150～180天的生長(zhǎng)周期，成為制約藏雞養(yǎng)殖的主要因素[14].

本研究通過(guò)Stem-loop RT-PCR克隆測(cè)序得到的3條miRNA序列的長(zhǎng)度分別為23bp、21bp和22bp，長(zhǎng)度滿足miRNA序列的基本特征，同時(shí)3條miRNA序列前體序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)經(jīng)預(yù)測(cè)均具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，滿足miRNA前體具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的基本特征.

為了進(jìn)一步研究3條miRNA序列miR-13＿529、miR-20＿1207和miR-24＿1302在藏雞肌肉發(fā)育過(guò)程中的作用，對(duì)3條miRNA序列的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè).miR-13＿529的靶基因STRBP可以調(diào)控肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)，KDM2B基因則可以通過(guò)與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肌肉細(xì)胞的增殖和發(fā)育[15].miR-20＿1207的 10個(gè)靶基因中，PACS2基因[16]、VCPIP1[17]基因、ARID2[18]基因則分別與細(xì)胞調(diào)亡、細(xì)胞有絲分裂以及細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān).miR-24＿1302的靶基因OCC-1也被證明在肌肉組織中具有較高的表達(dá)水平[19].綜上所述，3條miRNA序列預(yù)測(cè)得到的靶基因在細(xì)胞的增殖、發(fā)育、有絲分裂和凋亡的過(guò)程中均具有一定的作用，表明這3條miRNA序列可以與其靶基因結(jié)合從而調(diào)控藏雞肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育.

4 結(jié)論

本研究成功克隆得到藏雞肌肉組織中3條新發(fā)現(xiàn)的 miRNA序列，長(zhǎng)度分別為 miR-13＿529序列23bp，miR-20＿1207 序列 21bp，miR-24＿1302 序列22bp，并對(duì)其前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè).利用4個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件共同預(yù)測(cè)出3條miRNA序列可能的靶基因.本研究為進(jìn)一步探討3條新發(fā)現(xiàn)miRNA序列在調(diào)控藏雞肌肉發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ).