原曉龍，陳劍，陳中華，華梅，王娟，王毅

(云南省林業(yè)科學院,云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室,國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室,云南 昆明 650201)

滇牡丹(Paeoniadelavayi)是芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(Paeonia)牡丹組(Sect.Moutan)植物，是中國西南地區(qū)特有的多年生小灌木，是一種具極高觀賞價值特色園藝作物育種資源，已被列為國家二級保護植物[1-2]。滇牡丹包含園藝品種花瓣中少有的黃色性狀[3-5]，可作為培育含黃色花基因觀賞牡丹的重要育種材料。目前，對黃花滇牡丹花色素的分析發(fā)現(xiàn)其色素成分主要以糖苷形式存在，如異杞柳苷(Isosalipurposide,ISP)、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、金圣草黃素、芹菜素葡萄糖苷等經(jīng)過糖基化修飾的類黃酮糖苷[5-6]。黃酮類色素、萜類、激素及次生代謝產(chǎn)物的糖苷主要經(jīng)糖基化修飾形成，糖基化反應是一種典型的后修飾反應，存在于植物天然次生代謝產(chǎn)物合成的最后一步[7]，糖基化(Glycosylation)的修飾反應是由糖基轉移酶(Glycosyltransferases,GTs,EC 2.4.x.y)催化的[8]。GTs具一定的底物特異性和位置特異性，依據(jù)其二磷酸尿苷(UDP)糖基供體的不同，可分為UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖和UDP-半乳糖等[9]，如類黃酮2’-O-葡萄糖基轉移酶可在四羥基查爾酮(THC)的2’碳位添加葡萄糖進行糖基化，增加THC穩(wěn)定性和水溶性，并抑制外源性的糖苷酶的降解，使THC能夠大量累積于植物液泡中[10-11]；依據(jù)其碳位不同可分為3-O、5-O、7-O、3’-O等[8]。源于不同種類植物但具相同功能的糖基轉移酶通常歸屬于同一亞組[6]，如類黃酮7-O-葡萄糖基轉移酶(flavonoid 7-O-glucosyltransferase,7GT)可將UDP-糖基供體轉移到花色素的C7羥基(或羧基)上，7GT中已經(jīng)過功能鑒定的類黃酮7-O-葡萄糖基轉移酶基因有黃芩(Scutellariabacicalensis)的UBGT[12]、Glycyrrhizaechinata的UGT73F1[13]、洋蔥(Alliumcepa)的UGT73J1[14]及擬南芥(Arabidopsisthaliana)中的AtGT2[15]。這些說明類黃酮7-O-葡萄糖基轉移酶對類黃酮類物質具有一定的區(qū)域選擇性。雖然對不同植物的7-O-葡萄糖基轉移酶基因的克隆和功能鑒定有過一些報道，但尚未發(fā)現(xiàn)有關滇牡丹的類黃酮7-O-葡萄糖基轉移酶的研究報道。

目前研究人員對滇牡丹的紅色花瓣和黃色花瓣完成了轉錄組測序[16]，并對其類黃酮生物合成途徑進行了揭示，但關于滇牡丹花色素生物合成基因克隆及功能分析的文章報道較少，僅對滇牡丹3-O-葡萄糖基轉移酶的基因進行過克隆和表達分析[17]。為了更好地研究滇牡丹花色素的形成機制，本項目組在滇牡丹紅色、白色和黃色花瓣的轉錄組測序的基礎上，成功克隆到滇牡丹7-O-葡萄糖基轉移酶(Pd7GT)基因，并對其進行生物信息學分析、功能鑒定和轉錄模式分析，為通過基因工程技術培育具新性狀的園藝觀賞牡丹、研究色素形成機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

滇牡丹花瓣、根、莖、葉等組織采集于云南省迪慶州香格里拉市高山植物園(99°35′21.5″E，27°57′6.9″N)；其中，用于進行不同組織和不同發(fā)育時期花轉錄模式分析的各組織均采自同一株開黃色花的滇牡丹；而黃花、白花和紅花均是在花開時期采集其整朵花。采集后，放入50mL離心管中，用液氮保存后帶回實驗室，放置于-80℃冰箱中備用。

EasyPfu DNA聚合酶(北京全式金)、反轉錄試劑盒(北京全式金)、植物總RNA提取試劑盒(Qiagen)。

1.2 方法

1.2.1 滇牡丹各組織RNA提取及cDNA合成

將帶回的滇牡丹各組織部位、不同發(fā)育時期的花和不同顏色的花瓣置于液氮中研磨成粉末，在添加RNA提取液之前需要樣品始終處于液氮環(huán)境中，按照植物總RNA提取試劑盒說明書的各步驟操作。提取后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM2000(Thermo USA)檢測RNA的質量和濃度，完整且濃度合適的RNA置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用反轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成，按照說明書進行具體操作。反轉錄cDNA -20℃冰箱中備用。

1.2.2 滇牡丹Pd7GT基因的克隆

以源于巨桉(Eucalyptusgrandis)的查爾酮7-O-GT(7-O-glucosyltransferase，GenBank登錄號為XP_010066837)基因為模板，利用本地BLAST對滇牡丹花瓣的轉錄組數(shù)據(jù)進行搜索，獲得滇牡丹的7-O-GT基因(Pd7GT)序列，根據(jù)該基因序列設計特異引物(Pd7GT1F:5’-ATGACGAAAGCAGAGTTAGT-3’;Pd7GT1R:5’-TCATACAAAATATGCCCTAA-3’)。以滇牡丹紅花的花瓣cDNA為模板，以Pd7GT1F和Pd7GT1R作為引物，用EasyPfu DNA聚合酶擴增獲得Pd7GT全基因片段。通過瓊脂糖凝膠電泳將擴增產(chǎn)物純化回收后，連接到克隆載體上，經(jīng)過菌落PCR檢測后，送至上海生工測序。

1.2.3 滇牡丹Pd7GT基因cDNA序列及其蛋白氨基酸的生物信息學分析

獲得滇牡丹Pd7GT基因cDNA序列后，利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析獲得其蛋白氨基酸序列，借助于在線工具ProParam(http:/ /web.expasy.org /protparam/)預測Pd7GT蛋白的理化性質；用SignalP 4.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測該蛋白信號肽的有無；亞細胞定位用Target P(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/output.php)預測分析，用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)搜索Pd7GT蛋白結構功能域，通過NCBI對其cDNA和蛋白氨基酸序列進行同源序列搜索，選擇與Pd7GT蛋白序列一致性較高的植物糖基轉移酶蛋白序列，用MEGA 6.0中的Clustal W進行多序列比對后，采用鄰位相接法，構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.4 滇牡丹Pd7GT基因的轉錄水平分析

用植物總RNA提取試劑盒提取滇牡丹根、莖、葉、花瓣、花蕊及不同花發(fā)育時期花芽(花完全由花萼包裹)，花蕾(漏出紅色花瓣)，花開(花瓣全部展開)，花謝(授粉后1d)4個時期的花瓣等8個組織的總RNA，用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM2000分別測定RNA的質量和濃度后，進行反轉錄合成cDNA的第一條鏈。以特異引物TPd7GTF(5’-GATTCGTCCACCTCTCAT-3’)和TPd7GTR(5’-AATTGAAACAGATTGCAA-3’)檢測滇牡丹Pd7GT基因在根、莖、葉及花不同發(fā)育時期的具體表達情況；在篩選了大量內(nèi)參基因后，選擇表達情況基本一致的ubiquitin作為內(nèi)參基因，其引物序列為ubiquitinF(5’-ATGGGAACTGAGCAACGT-3’)和ubiquitinR(5’-AAACGCGTGAGGGATTTC-3’)。PCR擴增后用瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，并利用凝膠電泳圖像分析軟件GENE-SNAPS分析其積分光密度，并計算目的基因/內(nèi)參基因積分光密度的比值，用于柱形圖的繪制，以用作相對定量表達分析。

2 結果與分析

2.1 滇牡丹RNA提取

采集得到的滇牡丹不同組織器官、不同發(fā)育時期花及不同顏色的花瓣，用液氮保存帶回實驗室，按植物總RNA提取試劑盒的說明提取總RNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳(圖1)和NanoDropTM2000(Thermo USA)檢測后，將適宜濃度的總RNA反轉錄成cDNA。

圖1 滇牡丹各組織、各發(fā)育時期花和不同顏色花瓣RNA提取結果

2.2 滇牡丹Pd7GT基因全長的cDNA克隆及序列分析

以TPd7GTF和TPd7GTR作為特異引物，以滇牡丹cDNA為模板進行Pd7GT基因的克隆，將該目的片段通過克隆載體篩選后，送上海生工測序。該基因含有1 446bp的核酸片段，含完整的開放閱讀框(GenBank登錄號：KX394687)，可編碼481個蛋白氨基酸。

2.3 滇牡丹Pd7GT基因的生物信息學分析

用在線程序對Pd7GT基因的核酸及蛋白氨基酸進行生物信息學分析，用ORF Finder預測其開放閱讀框、ProParam預測其理化性質、SignalP 4.1 server預測信號肽存在與否、TargetP預測該蛋白的作用位置，結果顯示：組成該蛋白的氨基酸共481個，分子式為C2458H3845N659O703S18，相對分子質量54.45kDa，等電點(pI)6.10，帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)量為63個，帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)量為56個，脂肪族系數(shù)89.00，不穩(wěn)定系數(shù)(Ⅱ)經(jīng)計算其值為39.58，是一種穩(wěn)定蛋白；該蛋白信號肽值(S-score)最大可能值為0.235，其值較低，Pd7GT蛋白不存在信號肽剪切位點，且無跨膜結構；該蛋白發(fā)揮作用的亞細胞位置在線粒體的可能性為0.038、存在于分泌途徑的可能性為0.518、存在于細胞質基質的可能性為0.561，可靠等級為5，即可靠性較低，該蛋白可能存在于內(nèi)質網(wǎng)或細胞質基質中；用NCBI 上ORF Finder推測得到的Pd7GT基因的481個蛋白氨基酸與葡萄(Vitisvinifera)、棗(Ziziphusjujuba)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、毛果楊(Populustrichocarpa)等植物類黃酮7-O-糖基轉移酶的蛋白序列進行同源序列比對，這5條蛋白序列具74.6%的一致性，發(fā)現(xiàn)Pd7GT蛋白的C端具有糖基轉移酶所特有的PSPG盒子，其序列為GWAPQVMILEHEAVGGFVTHCGWNSTLEGISAGLPLVTWPIFAEQFYNEKL(圖2)。

圖2 滇牡丹Pd7GT同源蛋白的序列比對

圖3 滇牡丹Pd7GT與其他植物同源蛋白的分子系統(tǒng)進化樹

該序列中含糖基轉移酶識別區(qū)(WAPQV)和糖基配體綁定位點(HCGWNS)。同時依據(jù)相關文獻報道，將功能已知，且糖基配體比較明確的植物7GT蛋白從NCBI上下載下來，進行多序列比對后用鄰位相接法構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示：依據(jù)其糖基配體的不同可分為3組，分別是UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖和UDP-半乳糖，其中滇牡丹Pd7GT蛋白(KX394687)與可可(XP_007042481)、Herranniaumbratica(XP_021298085)、毛果楊(XP_006379195)、巨桉(XP_010066837)等以葡萄糖為糖基配體的類黃酮7-O-糖基轉移酶聚為一類。

2.4 滇牡丹Pd7GT基因的轉錄模式分析

對滇牡丹各組織、各發(fā)育時期的花及不同顏色花瓣進行轉錄模式分析，具體表達情況見圖4：Pd7GT基因在滇牡丹的不同組織中，各個部位均有表達，但其表達量差異顯著，莖中的表達量最高、葉次之、根中最為微弱，其表達量從高到低依次為莖>葉>花>根(圖4A)；在不同花發(fā)育時期，Pd7GT基因的表達量隨著花發(fā)育不斷降低，其表達量花芽、花蕾 、花開逐漸減小，但到花謝期該基因表達量陡增，從高到低依次為花謝期>花芽期>花蕾期>花開期(圖4A)；在不同顏色的花瓣中，Pd7GT基因的表達量從高到低為黃花 >紅花 >白花，其中該基因在紅花和白花中表達量較微弱，在黃花中強烈表達。

Pd7GT基因在不同組織及花發(fā)育時期的表達量Pd7GT基因在不同顏色花瓣中的表達量

圖4Pd7GT基因在滇牡丹中的表達情況

Fig.4 The expression levels ofPd7GTgene

3 討論

糖基轉移酶是一個超酶家族，能將各種糖基配體從活化的供體上轉移到受體上，幾乎存在于所有有機體中[18]。植物中的糖基供體主要為UDP-葡萄糖[19- 20]，還有少量的UDP-半乳糖[21]、UDP-鼠李糖[22]等；常見的糖基受體主要為單糖、低聚糖、多糖及非碳水化合物，如蛋白質、脂類及各種次生代謝產(chǎn)物[7]；一般糖基化部分發(fā)生在受體分子的不同O(羥基、羧基)、N(氨基)、S(巰基)和不同碳位原子間，形成3-、5-、7-、2’-等糖苷或糖酯，進而增加受體分子的親水性、穩(wěn)定性、生物活性等，改變該物質在細胞內(nèi)和有機體內(nèi)的運輸和儲存[7,23- 24]。糖基轉移酶對植物各方面均具有重要的作用，如生長發(fā)育、代謝調節(jié)、天然次生代謝產(chǎn)物合成和貯存、解除內(nèi)外源毒素活性等[25]。本文克隆獲得滇牡丹的7-O-葡萄糖基轉移酶基因序列，并通過生物信息學分析的手段進行確認及表達模式分析。

通過生物信息學對滇牡丹Pd7GT基因進行分析，Pd7GT蛋白是一種不存在信號肽剪切位點、無跨膜結構，在細胞中的細胞質部位發(fā)揮作用的穩(wěn)定蛋白，與糖基化反應發(fā)揮功能的部位一致；如黃酮類的花青素在合成天竺葵色素(Pelargonidin)、矢車菊色素(Cyanidin)、飛燕草色素(Delphididin)、芍藥色素(Peonidin)、牽?；ㄉ?Petunidin)和錦葵色素(Malvidin)等前體物質后，緊接著在細胞質中進行糖基化修飾作用[7,11,26]。糖基轉移酶超家族蛋白的一級結構在C端含有約44個保守氨基酸殘基，即含有該家族識別區(qū)和糖基配體綁定位點的PSPG盒子[7]，不同碳位(3-O、5-O、7-O等)及功能(轉移糖基配體的種類)的糖基轉移酶均具有該保守區(qū)域[26]，Pd7GT蛋白亦含有此區(qū)域，可推測該蛋白是一種糖基轉移酶。將功能已知的7-O-GT蛋白一起與Pd7GT進行聚類分析，該基因與糖基供體為UDP-葡萄糖聚為一支，綜合分析Pd7GT基因編碼的糖基轉移酶將UDP-葡萄糖轉移到受體分子的C7的羥基或羧基上；與其他碳位如3-O-GT等屬于不同的基因[17]；同時根據(jù)Pd7GT蛋白一級結構C端所含的44個保守區(qū)域和其糖基供體，該蛋白可歸為尿苷二磷酸糖基轉移酶(UGT)家族[20]，具催化植物天然次生代謝產(chǎn)物的合成和促進植物的生長發(fā)育功能[25]。

糖基轉移酶是一種分歧度極高的多源基因家族[20]，可依賴于酶蛋白的氨基酸殘基序列的相似性、催化特點及保守序列的有無等對其進行分類[18,27-28]。本研究中Pd7GT的聚類分析結果是以UDP-葡萄糖作為糖基供體添加到類黃酮的C7位羥基上，與其類似的還有UBGT在黃芩體內(nèi)對其主要類黃酮類物質黃芩黃素的C7位點顯示出最佳的親和性[12]；UGT73F1在Glycyrrhizaechinata對異黃酮formonetin具最佳親和力，而對槲皮黃酮(quercetin)、山柰酚(kaeopferol)的親和性最低[13]；經(jīng)過重組的UGT73J1可使洋蔥中的槲皮黃酮 3-O-葡糖苷轉化為槲皮黃酮3,7-O-雙葡糖苷[14]；擬南芥的AtGT2在體外大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達時對圣草酚苷(eriodictyol)顯示出極強親和力[15]。糖基轉移酶對受體的碳位點選擇具有一定的專一性，如在三花龍膽(Gentianatriflora)[29]、荷蘭鳶尾(Irishollandica)[30]等植物中催化花青素合成花青素3-O-糖苷的3GT，進一步催化花青素3-O-糖苷合成3,5-O-糖苷的5GT等；類黃酮的糖苷復合體可提高該類物質的穩(wěn)定性和轉運性，增加其在植物液泡內(nèi)的積累。糖基轉移酶的底物可是類黃酮，還可是萜烯類、激素及聚酮類等次生代謝物質[19]，GT在植物次生代謝產(chǎn)物合成及調節(jié)、貯存及植物生長發(fā)育等方面具重要作用[25]；在影響植物生長發(fā)育和抗性方面作用的發(fā)揮主要依賴于調節(jié)植物體內(nèi)激素含量水平的方式[31]；如研究人員在小麥(Triticumaestivum)中發(fā)現(xiàn)TaUGT73D1基因在雄蕊中表達量最高，而在雌蕊和雌蕊化的雄蕊中幾乎不表達，這一現(xiàn)象是通過小麥的TaUGT73D1蛋白調控小麥內(nèi)源激素ABA的含量來促使其雄蕊轉化為雌蕊[31]；花生中的AhUGT83A1-like基因在脅迫條件下能夠增加游離態(tài)ABA的含量和表達水平增加[32]。而基因表達實驗中，滇牡丹中Pd7GT基因在莖、葉和花芽中表達量較高，在花謝時期其表達量陡然升高，這一現(xiàn)象目前尚無法解釋，但因為本研究中的內(nèi)參基因是經(jīng)過篩選，且其表達量基本一致，可排除內(nèi)參基因的因素；究竟因何種原因造成這一現(xiàn)象需要進一步通過基因過表達或異源表達進行驗證；而在不同顏色花瓣中，在黃花花瓣中表達量較大，可能與該基因促進黃酮類物質積累和合成有關。本研究為研究滇牡丹糖基轉移酶異源表達、分子育種提供一定的基礎，為未來通過基因工程培育具新穎花色和抗性的新品種提供必要材料。