孫貴賓 常 娟* 尹清強 劉超齊 謝鳳蓮 王 平 黨曉偉 張志敏

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；2.河南德鄰生物制品有限公司，新鄉(xiāng) 453000；3.陜西省微生物研究所，西安 710043)

青貯是飼草保存的一種經(jīng)濟有效的方法，青貯過程中通過乳酸菌的發(fā)酵可以提高飼料的適口性和延長飼料的貯存期，如何讓乳酸菌快速地成為優(yōu)勢菌群是提高青貯質(zhì)量的關(guān)鍵性問題[1]。通過添加乳酸菌調(diào)控微生物的發(fā)酵，提高青貯飼料的品質(zhì)，在國內(nèi)外已有許多相關(guān)的報道[2-4]。酵母菌可改善青貯飼料的適口性和風(fēng)味，在厭氧環(huán)境下，酵母菌可分解糖，產(chǎn)生乙醇、乙酸、丙酸和少量的乳酸[5]。王富生等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在青貯過程中添加酵母菌可提高青貯飼料中的粗蛋白質(zhì)含量。任付平[7]研究發(fā)現(xiàn)，玉米秸稈青貯過程中添加酒精酵母可以增加其粗蛋白質(zhì)的含量，生成乙醇等物質(zhì)，使青貯飼料具有酒香味。

纖維素酶可以水解結(jié)構(gòu)性碳水化合物，增加纖維的降解，是改善青貯品質(zhì)、提高營養(yǎng)價值的一種行之有效的方法。蔡元[8]研究發(fā)現(xiàn)，在玉米秸稈青貯中添加和氏璧青貯酶可明顯改善其感官品質(zhì)，顯著提高粗蛋白質(zhì)含量，降低中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維的含量。Chilson等[9]研究表明，青貯飼料中添加纖維素酶和乳酸菌可提高青貯品質(zhì)，促進纖維降解。但復(fù)合益生菌和纖維素酶聯(lián)合處理的效果有待進一步研究。因此，本試驗利用纖維素酶和復(fù)合益生菌聯(lián)合處理全株玉米，研究其對全株玉米青貯的營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)的影響，為秸稈青貯添加劑的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的全株玉米來源于河南三色鴿乳業(yè)有限公司。試驗所用復(fù)合益生菌來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)飼料生物技術(shù)實驗室，包含植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，活菌數(shù)均調(diào)整為1.0×109CFU/mL。纖維素酶來自山東澤生生物科技有限公司，纖維素酶活力≥20 000 U/g。

1.2 試驗設(shè)計

試驗分為4個組，分別為對照組(不添加任何添加劑)、纖維素酶組(添加1 g/kg纖維素酶)、復(fù)合益生菌組(添加2 mL/kg復(fù)合益生菌，植物乳桿菌∶釀酒酵母=1∶1)、菌酶聯(lián)合組(添加1 g/kg纖維素酶和2 mL/kg復(fù)合益生菌)，每組3個重復(fù)。全株玉米收割后，每個聚乙烯真空包裝袋填充秸稈500 g，并用真空包裝機真空封口，室溫青貯發(fā)酵45 d后開袋，對其感官評分、營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)進行測定。

1.3 指標測定

1.3.1 感官評定

感官評定方法采用德國農(nóng)業(yè)協(xié)會(DLG)評分法，根據(jù)色澤、氣味、結(jié)構(gòu)進行評分，將青貯飼料評定為下(0～4分)、中(5～9分)、可(10～15分)、優(yōu)(16～20分)4個等級[10]。

干物質(zhì)含量的測定：采用烘干恒重法[11]。粗蛋白質(zhì)含量的測定：采用凱氏定氮法[11]。粗脂肪含量的測定：采用索氏脂肪提取法[11]。粗灰分含量的測定：采用灰化法[11]。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、纖維素、半纖維素、酸性洗滌木質(zhì)素含量的測定：參照范氏(Van Soest)洗滌纖維分析法[12]。鈣含量的測定：采用乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法[13]。磷含量的測定：采用鉬黃分光光度法[13]。

1.3.3 發(fā)酵品質(zhì)測定

pH測定：稱取10 g樣品于250 mL的三角瓶中，加入90 mL蒸餾水，于搖床上150 r/min振蕩10 min，通過定性濾紙過濾，所制備的青貯飼料浸提液采用pHS-3C pH計進行測定。氨態(tài)氮含量的測定：采用苯酚-次氯酸比色法[14]?？扇苄蕴妓衔锖康臏y定：采用蒽酮-硫酸比色法[15]。

1.3.4 微生物菌落數(shù)測定

稱取10 g樣品于250 mL滅菌的三角瓶中，加入90 mL質(zhì)量分數(shù)為0.9%的滅菌生理鹽水，搖勻后將此溶液稀釋10～106倍。乳酸菌用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，酵母菌用麥芽浸膏瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，需氧菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)。乳酸菌和需氧菌在37 ℃培養(yǎng)48 h，微生物酵母菌在30 ℃培養(yǎng)48 h。微生物菌落數(shù)用平板計數(shù)法進行測定，結(jié)果以每克青貯飼料所含的微生物菌落數(shù)來表示[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并用Duncan氏法對組間進行多重比較，P<0.05為差異顯著，結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié) 果

2.1 全株玉米營養(yǎng)成分分析

青貯前進行取樣，測定原料中營養(yǎng)成分含量，全株玉米的營養(yǎng)組成如表1所示。全株玉米中含有較高的粗蛋白質(zhì)，其含量為8.35%。

M井為含H 2 S、CO2的高溫高壓氣井，施工前套壓47.5 MPa、油壓59 MPa。該井井口裝置存在閥板、閥座鍍層脫落、本體和鋼圈槽坑蝕嚴重等問題?，F(xiàn)有帶壓修井作業(yè)對于這樣的高壓含硫井存在安全風(fēng)險，因此設(shè)計向油管內(nèi)注入暫堵壓井膠塞，利用膠塞成膠后的高黏彈性來降低井口油壓，防止含硫氣與壓井液置換，避免常規(guī)加重壓井液對地層的污染，再通過不丟手帶壓更換主控閥技術(shù)對油管頭異徑法蘭和各種閥門進行更換，消除安全隱患。表5為膠塞施工程序。

表1 全株玉米的營養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

2.2 不同添加劑處理對全株玉米青貯營養(yǎng)成分的影響

由表2可知，纖維素酶組和菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯的粗蛋白質(zhì)含量均顯著高于對照組(P<0.05)，其中菌酶聯(lián)合組的粗蛋白質(zhì)含量最高，為9.95%。菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量顯著低于對照組、纖維素酶組和復(fù)合益生菌組(P<0.05)。菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯的纖維素含量顯著低于對照組(P<0.05)，與纖維素酶組差異不顯著(P>0.05)。菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯的酸性洗滌木質(zhì)素含量顯著低于纖維素酶組(P<0.05)。菌酶聯(lián)合組和纖維素酶組全株玉米青貯的粗灰分含量顯著高于其他2組(P<0.05)。各組之間的粗脂肪、半纖維素、鈣和磷含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組全株玉米青貯的營養(yǎng)組成(干物質(zhì)基礎(chǔ))

同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 不同添加劑處理對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表3可知，試驗組全株玉米青貯的感官評分均高于對照組，菌酶聯(lián)合組的評分最高,為19分，各試驗組評分在16～19分，為優(yōu)等，香味較濃。與對照組相比，試驗組全株玉米青貯的pH均顯著降低(P<0.05)，其中復(fù)合益生菌組pH最低。菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯中的氨態(tài)氮/總氮顯著低于對照組和纖維素酶組(P<0.05)。試驗組全株玉米青貯的可溶性碳水化合物含量均顯著低于對照組(P<0.05)。

表3 各組全株玉米青貯的發(fā)酵品質(zhì)

2.4 不同添加劑處理對全株玉米青貯微生物菌落數(shù)的影響

由表4可知，對照組和復(fù)合益生菌組的乳酸菌的數(shù)量顯著高于纖維素酶組和菌酶聯(lián)合組(P<0.05)。菌酶聯(lián)合組酵母菌的數(shù)量顯著低于其他試驗組和對照組(P<0.05)。菌酶聯(lián)合組需氧菌的數(shù)量顯著低于復(fù)合益生菌組(P<0.05)，與其他各組差異不顯著(P>0.05)。

表4 各組全株玉米青貯微生物菌落數(shù)

3 討 論

3.1 全株玉米營養(yǎng)成分

青貯飼料的營養(yǎng)價值主要取決于原料的營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質(zhì)的好壞，歐美等畜牧業(yè)發(fā)達國家在秸稈利用方面基本上是選用全株青貯。本試驗中選用全株玉米含有相對較高的粗蛋白質(zhì)和中性洗滌纖維，這可能與玉米品種有關(guān)。許慶方等[17]研究表明，不同的玉米品種之間粗蛋白質(zhì)、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量有較大的差異。本試驗所選用的品種為登海518，是河南南陽地區(qū)廣泛推廣使用的一種全株青貯玉米品種。

3.2 不同添加劑處理對全株玉米青貯營養(yǎng)成分的影響

纖維素酶可降解植物細胞壁的結(jié)構(gòu)性多糖為單糖，并為微生物發(fā)酵提供充分的底物，改善青貯飼料品質(zhì)[18-19]。本試驗中纖維素酶組和菌酶聯(lián)合組的粗蛋白質(zhì)含量顯著高于對照組，這可能與纖維成分的降解促進了微生物的生長有關(guān)。酵母菌自身含有較高的蛋白質(zhì)，因此在飼料發(fā)酵行業(yè)應(yīng)用廣泛，青貯中添加酵母，既可以提高青貯粗蛋白質(zhì)含量增加營養(yǎng)價值，又可改善青貯飼料的香味[20-21]。張強等[22]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳桿菌與釀酒酵母配比可提高青貯料的粗蛋白質(zhì)含量。張相倫等[23]的研究表明，在玉米青貯中添加纖維素酶和乳酸菌制劑可提高青貯料中的粗蛋白質(zhì)含量。

本試驗中菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯中的酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量均顯著低于其也各組，纖維素含量也顯著低于對照組和復(fù)合益生菌組，酸性洗滌木質(zhì)素含量顯著低于纖維素酶組，說明菌酶聯(lián)合處理對全株玉米中纖維成分的降解利用效果最好。纖維素酶組和復(fù)合益生菌組全株玉米青貯的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量與對照組均差異不顯著，說明單一添加酶和單一添加復(fù)合菌均不能促進全株玉米中纖維的降解。Ni等[24]的研究表明，纖維素酶和乳酸菌共同添加可顯著降低青貯料的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。譚樹義等[25]的研究也同樣說明，玉米秸稈青貯時添加復(fù)合酶和乳酸菌制劑可顯著降低其中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量。王興剛[26]發(fā)現(xiàn)，乳酸菌+酶制劑處理顯著提高了青貯稻秸的粗蛋白質(zhì)含量，極顯著降低了青貯稻秸的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，在整體改善效果上，乳酸菌+酶制劑>酶制劑>乳酸菌。本試驗結(jié)果中纖維素酶組粗灰分含量反而顯著升高，具體原因有待進一步研究。綜合結(jié)果表明，菌酶聯(lián)合組與單一處理組相比，顯著提高了青貯飼料的營養(yǎng)價值。

酶制劑對秸稈纖維成分的降解作用已被國內(nèi)外許多的研究所證明[27-30]。本試驗中纖維素酶組和復(fù)合益生菌組相比，纖維素酶組全株玉米青貯的纖維素含量顯著低于復(fù)合益生菌組，中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量有降低的趨勢，但差異不顯著，說明纖維素酶組對全株玉米纖維成分降解的效果優(yōu)于復(fù)合益生菌組，這可能是由于復(fù)合益生菌中的乳酸菌和酵母菌不能分泌纖維素酶，對全株玉米纖維成分無降解作用。

3.3 不同添加劑處理對全株玉米青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

纖維素酶處理和復(fù)合益生菌處理均在一定程度上提高了青貯飼料的感官評分，其中菌酶聯(lián)合處理的效果尤為明顯，酸香味較濃，質(zhì)地柔軟，這與張強等[22]關(guān)于乳桿菌和釀酒酵母菌復(fù)配的發(fā)酵劑改善飼料品質(zhì)的研究結(jié)果相一致，感官評定的結(jié)果也與菌酶聯(lián)合處理更能有效降解全株玉米青貯中纖維成分的結(jié)論相一致。

纖維素酶和復(fù)合益生菌的添加對全株玉米青貯pH均有顯著的降低作用，其中復(fù)合益生菌的添加對全株玉米青貯pH具有更顯著的影響作用。乳酸菌是青貯成功的關(guān)鍵之一，要使乳酸菌盡快繁殖，每克原料必須有105以上個乳酸菌[7]，酵母菌發(fā)酵后可增加青貯料的營養(yǎng)價值，改善其適口性[31-32]，因此添加復(fù)合益生菌(植物乳桿菌和釀酒酵母)可增加乳酸菌數(shù)量，迅速降低青貯料的pH，抑制有害微生物的活動，減少營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，改善青貯品質(zhì)。本試驗中，復(fù)合益生菌和纖維素酶的添加顯著降低了青貯料的pH，這說明這2種添加劑具有良好的青貯效果。

青貯飼料中的氨態(tài)氮主要由植物酶和微生物對蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生，氨態(tài)氮/總氮反映了青貯飼料蛋白質(zhì)的降解程度[23]。菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯的氨態(tài)氮/總氮顯著降低，這說明該組發(fā)酵效果較好，可能是因為pH的急劇下降，抑制了好氧微生物和植物酶的活性，減少了粗蛋白質(zhì)的分解，降低了氨態(tài)氮含量。

本試驗中纖維素酶和復(fù)合益生菌共同添加時，對青貯料的青貯品質(zhì)影響效果較好。Chen等[33]發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶和乳酸菌制劑組合添加與單一添加相比可進一步提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。Nadeau等[34]發(fā)現(xiàn)，青貯過程中同時添加復(fù)合酶和乳酸菌制劑，既提高了青貯發(fā)酵初期乳酸菌的數(shù)量，又增加了乳酸發(fā)酵的底物，可以獲得協(xié)同增效的作用。興麗等[35]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌和纖維素酶共同添加可顯著降低玉米青貯的pH和氨態(tài)氮/總氮。本試驗中，所有組的可溶性碳水化合物含量與對照組相比顯著降低，全株玉米本身含有較為豐富的可溶性碳水化合物，為乳酸菌的定植提供了豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，因此益生菌的生長可能利用了全株玉米中的可溶性碳水化合物，也可能與菌和酶之間的復(fù)雜作用有關(guān)，更深入的原因有待進一步研究。

3.4 不同添加劑處理對全株玉米青貯微生物菌落數(shù)的影響

本試驗中，菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯中乳酸菌和酵母菌的數(shù)量和對照組相比均顯著降低，這與該組全株玉米青貯具有較低的pH有關(guān)。Xing等[28]和Cai等[36]的研究表明，低pH抑制微生物的生長。復(fù)合益生菌組全株玉米青貯雖然具有較低的pH，但乳酸菌數(shù)量卻顯著高于纖維素酶組和菌酶聯(lián)合組，這可能是益生菌中的乳酸菌為秸稈青貯優(yōu)勢菌，在青貯飼料中添加后大量生長和繁殖的原因。

乳酸菌是青貯成功的關(guān)鍵微生物，青貯前期乳酸菌快速繁殖產(chǎn)生大量乳酸，使pH迅速降低到4.2以下，從而抑制有害菌的繁殖。酵母菌可改善青貯飼料的適口性和風(fēng)味，在厭氧環(huán)境下，酵母菌可分解糖，產(chǎn)生乙醇、乙酸、丙酸和少量的乳酸。在好氧環(huán)境下，酵母菌可氧化糖，產(chǎn)生水和二氧化碳[37]。青貯飼料含有很多微生物，其中乳酸菌的種類和數(shù)量最多，在青貯過程中起主要作用，酵母菌和需氧菌在青貯保存過程中數(shù)量較少，一旦青貯飼料與空氣接觸，酵母菌和需氧菌開始活躍并使青貯飼料開始腐敗變質(zhì)[38]。本試驗結(jié)果表明，青貯45 d后全株玉米青貯中需氧菌的數(shù)量和Liu等[19]、Xing等[28]的研究相比偏高，可能和聚乙烯塑料袋法青貯有關(guān)。苗芳等[39]用同樣的方法添加不同菌劑青貯全株玉米，60 d后青貯料中需氧菌的數(shù)量和初始原料相比顯著降低。興麗等[35]測定乳酸菌青貯全株玉米中酵母菌的數(shù)量也達到了106CFU/g以上。因本試驗未對發(fā)酵前全株玉米中的菌群進行測定，這2種菌落數(shù)值偏高的原因還有待進一步研究。試驗中菌酶聯(lián)合組全株玉米青貯中的酵母菌和需氧菌的數(shù)量相對其他各組顯著降低，說明該組飼料青貯發(fā)酵之后的品質(zhì)相對較好。

4 結(jié) 論

纖維素酶和復(fù)合益生菌的聯(lián)合處理顯著提高了青貯飼料中粗蛋白質(zhì)含量，降低了青貯飼料中中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和纖維素含量，降低了青貯飼料的pH和氨態(tài)氮/總氮，減少了其中乳酸菌、酵母菌和需氧菌的數(shù)量，有效提高了全株玉米青貯的營養(yǎng)價值和品質(zhì)。