陳慶菊 劉金艷 盧昌文 馬婭君 唐志如

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院，生物飼料與分子營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

抗生素具有提高動物生產(chǎn)性能、降低腹瀉率和抑制腸道有害菌生長等多方面功效[1]。雖然這些優(yōu)點(diǎn)使其在動物生產(chǎn)中獲得廣泛使用，但是抗生素的濫用、過度使用導(dǎo)致耐藥性[2]和肉類食品中抗生素殘留等問題，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，歐盟于2006年開始全面禁用抗生素，近年來我國也逐漸加大了對抗生素的限用力度。然而，減少抗生素的使用，會大大增加動物對病原菌的易感性，嚴(yán)重威脅動物的健康，給動物生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，目前迫切需要尋找一種可行的措施來解決這一現(xiàn)狀。

β-葡聚糖是一類廣泛分布于動物、植物和微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的多糖。燕麥?zhǔn)禽^理想的β-葡聚糖的來源，燕麥β-葡聚糖的基本結(jié)構(gòu)是由β-1，4和β-1，3糖苷鍵連而形成的短鏈葡聚糖[3]。不同植物中的β-葡聚糖化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，但分子中的β-1，4和β-1，3糖苷鍵存在差異，燕麥β-葡聚糖中2個(gè)糖苷鍵的比值一般認(rèn)為是2.1～2.4[4]。研究發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖具有促進(jìn)動物生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗癌等作用[5]。此外，β-葡聚糖能抑制大腸桿菌、沙門氏菌等有害細(xì)菌生長，促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌生長，在維持腸道微生態(tài)平衡和促進(jìn)動物健康方面發(fā)揮著重要的作用[6-7]。因此，本研究旨在研究β-葡聚糖對榮昌內(nèi)三元斷奶仔豬的生長性能、腸道微生物區(qū)系和氨基酸脫羧酶活力的影響，為β-葡聚糖在斷奶仔豬上的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用30頭28日齡斷奶健康的(大約克×榮昌)×長白內(nèi)三元雜交閹公仔豬，采取單因素完全隨機(jī)分組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分3個(gè)組：對照組(基礎(chǔ)飼糧)、桿菌肽鋅組(在基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg/kg桿菌肽鋅，桿菌肽鋅購自大東方動物藥業(yè)有限公司)、β-葡聚糖組(在基礎(chǔ)飼糧中添加400 mg/kg β-葡聚糖，β-葡聚糖購自安徽中南科技生物有限公司，純度99%)。每個(gè)組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭仔豬。試驗(yàn)在西南大學(xué)養(yǎng)殖場進(jìn)行。試驗(yàn)預(yù)試期4 d，正試期28 d。預(yù)試期后即正試期第1天08：00空腹稱重并記錄初重，正試期結(jié)束后次日08：00空腹稱重并記錄末重。

1.2 飼養(yǎng)管理和飼糧組成

本次試驗(yàn)動物采用單欄飼養(yǎng)，飼喂粉料飼糧，每天共投料3次(08:00、12:00和18:00)，自由飲水，室內(nèi)溫度保持在25～30 ℃?；A(chǔ)飼糧參照NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 指標(biāo)測定和方法

1.3.1 生長性能和腹瀉指數(shù)的測定

按以下公式計(jì)算生長性能：

平均日增重(g/d)=全期增重(g)/試驗(yàn)天數(shù)(d)；平均日采食量(g/d)=全期采食量(g)/試驗(yàn)天數(shù)(d)；料重比=平均日采食量(g/d)/平均日增重(g/d)。

試驗(yàn)期間每天觀察仔豬發(fā)病和腹瀉情況。目測糞便狀態(tài)及統(tǒng)計(jì)腹瀉指數(shù)，評分標(biāo)準(zhǔn)為：正常糞便記5分，成型軟便記3～4分，不成型稀糞記1～2分，水樣糞、黏液便或膿血便記0分。腹瀉指數(shù)為試驗(yàn)期每頭豬腹瀉評分之和除以試驗(yàn)天數(shù)。腹瀉指數(shù)的高低反映腹瀉程度的輕重。腹瀉指數(shù)越高，表明仔豬腹瀉情況越低；相反，腹瀉指數(shù)越低，仔豬腹瀉程度越嚴(yán)重。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1)預(yù)混料每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of the diet：VA 3 500 IU，VD3320 IU，VE 18 IU，VK 1.3 mg，泛酸 pantothenic acid 12.2 mg，核黃素 riboflavin 4.5 mg，葉酸 folic acid 0.31 mg，尼克酸 niacin 31.0 mg，硫胺素 thiamine 1.2 mg，VB64.7 mg，生物素biotin 0.05 mg，VB120.018 mg，膽堿 choline 0.51 g，Zn 100 mg，F(xiàn)e 100 mg，Mn 4.5 mg，Cu 6.5 mg，I 0.3 mg，Se 0.3 mg。2)營養(yǎng)水平為計(jì)算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3.2 腸道內(nèi)容物的采集及微生物的分離

試驗(yàn)結(jié)束后每組選取5頭體重相近的仔豬進(jìn)行頸動脈放血，剖開胸腔和腹腔，迅速采集回腸、結(jié)腸內(nèi)容物20 g左右于離心管中，液氮速凍,用于微生物的分離。測定腸道內(nèi)容物微生物氨基酸脫羧酶活力及氨基酸組成，方法參照賴星等[8]的方法進(jìn)行。收集結(jié)腸內(nèi)容物于10 mL離心管中，置于-80 ℃保存，用于DNA的提取。

1.3.3 腸道微生物氨基酸脫羧酶活力的測定

將分離所得的微生物樣品梯度解凍后，于10 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，傾去上清，用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)清洗沉淀2～3次，同樣條件下離心棄上清。將帶有沉淀的離心管置于冰上待用。將收集的沉淀用生理鹽水稀釋至600 nm波長處的吸光度值(OD600)為0.8的溶液。取OD600為0.8的菌懸液10 mL，于10 000 r/min、4 ℃離心5 min后，傾去上清，將帶有沉淀離心管插入冰中待用。在預(yù)冷的沉淀中加入500 μL預(yù)冷生理鹽水，用振幅30 μm超聲處理20 s后，置于冰上冷卻。反復(fù)超聲處理3次，使細(xì)胞充分破碎。將破碎液于16 000 r/min、4 ℃條件下離心15 min。小心地移取上清液并分裝至預(yù)冷的1.5 mL離心管中后，置于冰槽里待用。氨基酸脫羧酶活力的測定參照唐志如等[9]的方法進(jìn)行。

1.3.4 結(jié)腸微生物區(qū)系的測定

結(jié)腸內(nèi)容物DNA的提取按照試劑盒Power Fecal DNA Isolation Kit(購自MO BIO Laboratories)進(jìn)行。提取的DNA進(jìn)行微生物高通量測序[10]。具體測定步驟如下：將檢測合格的樣品DNA構(gòu)建文庫，回收目的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，用T4 DNA聚合酶、克列諾(Klenow)DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶(PNK)將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端，再通過3′端加堿基腺嘌呤(A)，使得DNA片段能與3′端帶有胸腺嘧啶(T)堿基的特殊接頭連接；設(shè)計(jì)合成含有測序接頭的雙索引融合引物，以基因組DNA為模板，進(jìn)行融合引物PCR，磁珠篩選目的擴(kuò)增產(chǎn)物片段，用合格的文庫進(jìn)行集群制備和測序，對測序得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的生物信息分析[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2013和SAS 9.2軟件進(jìn)行整理和方差分析，組間差異性比較采用LSD法，結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧添加β-葡聚糖對斷奶仔豬生長性能的影響

由表2可知，β-葡聚糖組和桿菌肽鋅組的仔豬末重、平均日增重、平均日采食量和腹瀉指數(shù)均顯著高于對照組(P<0.05)，料重比顯著低于對照組(P<0.05)。β-葡聚糖組與桿菌肽鋅組相比，仔豬末重、平均日增重、平均日采食量、腹瀉指數(shù)和料重比差異均不顯著(P>0.05)。

表2 飼糧添加β-葡聚糖對斷奶仔豬生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表3同。Values with different small letter superscripts within the same row mean significant difference (P<0.05). The same as Table 3.

2.2 飼糧添加β-葡聚糖對斷奶仔豬腸道微生物氨基酸脫羧酶活力的影響

由表3可知，桿菌肽鋅組斷奶仔豬回腸微生物色氨酸脫羧酶活力顯著高于對照組和β-葡聚糖組(P<0.05)，對照組與β-葡聚糖組之間差異不顯著(P<0.05)。回腸蛋氨酸脫羧酶活力的大小依次為桿菌肽鋅組、對照組、β-葡聚糖組，且各組之間差異顯著(P<0.05)，其中β-葡聚糖組比桿菌肽鋅組降低了86.03%。桿菌肽鋅組回腸微生物賴氨酸脫羧酶活力顯著高于對照組和β-葡聚糖組(P<0.05)，對照組與β-葡聚糖組之間差異不顯著(P>0.05)?；啬c微生物鳥氨酸脫羧酶活力3組之間均差異不顯著(P>0.05)，β-葡聚糖組分別比桿菌肽鋅組和對照組降低了35.36%和3.13%。在結(jié)腸中，β-葡聚糖組和桿菌肽鋅組結(jié)腸微生物蛋氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，β-葡聚糖組與桿菌肽鋅組之間差異不顯著(P>0.05)。斷奶仔豬結(jié)腸微生物賴氨酸脫羧酶活力的大小依次為對照組、桿菌肽鋅組、β-葡聚糖組，且各組之間差異顯著(P<0.05)。桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組結(jié)腸微生物色氨酸脫羧酶活力顯著高于對照組(P<0.05)，而桿菌肽鋅組與β-葡聚糖組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 飼糧添加β-葡聚糖對斷奶仔豬腸道微生物氨基酸脫羧酶活力的影響

2.3 結(jié)腸微生物區(qū)系分析

2.3.1 物種注釋分析

由圖1可以直觀看出不同物種在每個(gè)樣品中所占的比例。通過β多樣性分析可知，斷奶仔豬飼糧中添加β-葡聚糖和桿菌肽鋅提高了斷奶仔豬結(jié)腸微生物的相對豐度，且桿菌肽鋅和β-葡聚糖效果是相當(dāng)?shù)?。由圖1-A可知，在門水平上，3個(gè)組中的擬桿菌門、厚壁菌門、螺旋體菌門和WPS-2是斷奶仔豬結(jié)腸微生物組成的主要優(yōu)勢菌群，占到結(jié)腸微生物的90%以上。由圖1-B可知，β-葡聚糖組螺旋體綱微生物相對豐度顯著高于對照組和桿菌肽鋅組(P<0.05)；對照組擬桿菌綱微生物相對豐度顯著高于桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組(P<0.05)；桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組桿菌綱微生物相對豐度高于對照組(P<0.05)；梭狀芽孢桿菌綱微生物相對豐度從大到小依次為桿菌肽鋅組、對照組、β-葡聚糖組，并且差異顯著(P<0.05)。由圖1-C可知，β-葡聚糖組螺旋體科微生物相對豐度顯著高于對照組和桿菌肽鋅組(P<0.05)；擬桿菌科微生物相對豐度從大到小依次為對照組、桿菌肽鋅組、β-葡聚糖組，并且差異顯著(P<0.05)；乳酸桿菌科微生物相對豐度β-葡聚糖組和桿菌肽鋅組顯著高于對照組(P<0.05)；梭狀芽孢桿菌科微生物相對豐度對照組和桿菌肽鋅組顯著高于β-葡聚糖組(P<0.05)。

2.3.2 物種熱圖分析

根據(jù)門水平熱圖(圖2-D)可知，3組厚壁菌門、擬桿菌門相對豐度都比較高，并且β-葡聚糖組螺旋體菌門微生物的相對豐度高于其他2組；由橫向類聚的枝長和距離情況可知，對照組和桿菌肽鋅組的結(jié)腸微生物相對豐度和組成相似，而β-葡聚糖組和另外2組在物種豐度和組成均存在差異；由縱向聚類得出厚壁菌門和擬桿菌門在各組中的相對豐度和組成相似，且相對豐度高于其他物種。此外，由縱向類聚還得出變形菌門和厚壁菌門在各組中的相對豐度和組成相似，其相對豐度不高。根據(jù)綱水平熱圖(圖2-E)可知，在綱水平，橫向聚類結(jié)果得出桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組物種相對豐度和組成相似，并且由顏色圖標(biāo)可知，各結(jié)腸微生物在桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組的相對豐度要高于對照組；而縱向類聚可知擬桿菌綱和梭狀芽孢桿菌綱在各組相對豐度及組成相似，并且相對豐度高于其他物種；螺旋體綱和桿菌綱在各樣品中的相對豐度和組成相似。根據(jù)目水平熱圖(圖2-F)可知，桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組結(jié)腸微生物相對豐度和組成相似，結(jié)合數(shù)值分析可知，β-葡聚糖組和桿菌肽鋅組的相對豐度高于對照組；由縱向類聚可知，擬桿菌目和梭狀芽孢桿菌目在各組中的相對豐度和組成相似，并且相對豐度高于乳酸桿菌目和螺旋體菌目及其他物種；乳酸桿菌目和螺旋體菌目在各組中的相對豐度和組成相似。根據(jù)科水平熱圖(圖2-G)可知，桿菌肽鋅組和β-葡聚糖組結(jié)腸微生物的相對豐度和組成相似，且相對豐度高于對照組。乳酸桿菌的相對豐度在β-葡聚糖組和桿菌肽鋅組高于對照組。螺旋體科在β-葡聚糖組相對豐度高于其他2組；由縱向聚類分析可知，普雷沃氏菌科和韋榮球菌科在各組的相對豐度相似，并且其相對豐度高于其他物種。此外，各組毛螺菌科菌的相對豐度相似，但由圖上的數(shù)值可知，對照組和β-葡聚糖組高于桿菌肽鋅組。

A、B、C分別為門、綱、目水平物種注釋。1為對照組，2為桿菌肽鋅組，5為β-葡聚糖組。圖2同。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，與桿菌肽鋅組相比，斷奶仔豬飼糧中添加β-葡聚糖顯著降低斷奶仔豬回腸中色氨酸脫羧酶、蛋氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶的活力；與對照組相比，β-葡聚糖組回腸鳥氨酸脫羧酶和賴氨酸脫羧酶的活力均有所降低但差異不顯著。在結(jié)腸中，與對照組相比，斷奶仔豬飼糧中添加β-葡聚糖顯著降低蛋氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的活力；雖然添加桿菌肽鋅對降低蛋氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的活力也具有顯著性效果，但降低程度不如β-葡聚糖。因此我們認(rèn)為，斷奶仔豬飼糧添加β-葡聚糖能有效地降低回腸和結(jié)腸微生物氨基酸脫羧酶活力，繼而有利于降低回腸和結(jié)腸中生物胺的濃度和減少仔豬疾病的發(fā)生。氨基酸脫羧酶是指催化脫去某種氨基酸的羧基，生成對應(yīng)的胺的裂解酶的總稱。在細(xì)菌中已知的脫羧酶有分別對應(yīng)于賴氨酸-尸胺、酪氨酸-酪胺、精氨酸-鯡精胺、鳥氨酸-腐胺、谷氨酸-γ-氨基丁酸等專一性的脫羧酶，這些均以磷酸吡哆醛為輔酶。在動物組織中對這些氨基酸脫羧也各有專門作用的酶。動物體內(nèi)由氨基酸脫羧生成的胺類在生理和藥理方面有重要的作用，在細(xì)菌中有中和酸性培養(yǎng)基的作用。脫羧酶脫羧需要輔酶磷酸吡哆醛誘導(dǎo)。賴氨酸脫羧后變成對應(yīng)有毒性的尸堿。脫羧作用會產(chǎn)生多種生物胺，體內(nèi)生物胺的濃度低時(shí)，對動物影響不大，而且低濃度的生物胺是機(jī)體必不可少的，一旦濃度過高，將引起宿主發(fā)生疾病例如腹瀉[12]。生成的生物胺還會降低腸道的緊密連接和通透性，同時(shí)會降低蛋白質(zhì)的利用率。

D、E、F、G分別為門、綱、目、科水平物種的相對豐度。

在本研究中，飼糧添加β-葡聚糖后降低了斷奶仔豬結(jié)腸中梭狀芽孢桿菌的相對豐度，這可能是脫羧酶活力下降的一個(gè)原因。有研究發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌和消化鏈球菌主要降解一些氨基酸產(chǎn)生生物胺，如降解絲氨酸產(chǎn)生乙醇胺、降解賴氨酸產(chǎn)生尸胺和降解天冬氨酸產(chǎn)生天門冬酰胺等[13]。機(jī)體中的大腸桿菌也經(jīng)常通過脫羧作用產(chǎn)生生物胺，而本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加β-葡聚糖降低了腸桿菌屬菌群的相對豐度。因此，我們得出β-葡聚糖降低脫羧酶活力的一種可能潛在機(jī)制：β-葡聚糖通過降低腸道中產(chǎn)生生物胺的菌群豐度來降低腸道微生物脫羧酶的活力。

腸道中的微生物種類很多，豬腸道中的微生物最主要由厚壁菌門和擬桿菌門構(gòu)成，其中厚壁菌門的比例占35%～80%，擬桿菌門占17%～60%，2個(gè)菌門有30多個(gè)屬、500～1 000種菌[14-15]。本研究采用高通量進(jìn)行測序和分析，在門水平，斷奶仔豬飼糧中添加β-葡聚糖和桿菌肽鋅組與對照組相比，厚壁菌門和擬桿菌門仍是優(yōu)勢菌門，可見添加β-葡聚糖和桿菌肽鋅并不會造成腸道微生態(tài)的改變。腸道菌群中某些擬桿菌門細(xì)菌基因組中含有較多編碼糖苷水解酶和多糖裂解酶的基因，編碼的酶類能促進(jìn)多糖的降解[16]。本研究在門水平、綱水平、目水平上均發(fā)現(xiàn)擬桿菌門是主要的腸道微生物，且β-葡聚糖組中擬桿菌門的相對豐度和桿菌肽鋅組是相當(dāng)?shù)摹＆?葡聚糖組和桿菌肽鋅組有益菌乳酸桿菌科微生物的相對豐度高于對照組，乳酸桿菌在腸道內(nèi)可通過產(chǎn)生乳酸來降低腸道的pH進(jìn)而殺死在低pH下無法生長的細(xì)菌，如大腸桿菌、沙門氏菌，這與周懌等[17]和王忠等[18]的研究一致。對照組和桿菌肽鋅組的梭狀芽孢桿菌科微生物相對豐度高于β-葡聚糖組。毛螺菌科在豬腸道中能降解纖維，有助于將不易消化的纖維素降解為單糖和短鏈脂肪酸，為宿主提供能量[19]。在科水平，本研究結(jié)果表明對照組和β-葡聚糖組的毛螺菌科微生物相對豐度高于桿菌肽鋅組。腸道梭菌屬中的致病菌會分解肌肉組織和結(jié)締組織等組織中的糖，產(chǎn)生氣體，導(dǎo)致嚴(yán)重氣腫和造成組織壞死，因此被認(rèn)為是有害菌，并且梭菌屬和腸桿菌科的比例升高會引起壞死性小腸結(jié)腸炎[20]。在本研究中，斷奶仔豬飼糧中添加β-葡聚糖和桿菌肽鋅，降低了芽孢桿菌科微生物的相對豐度，其中的梭菌屬屬于芽孢桿菌科。此外，通過β多樣性分析可知，斷奶仔豬飼糧中添加β-葡聚糖和桿菌肽鋅提高了斷奶仔豬結(jié)腸微生物菌群的相對豐度，且桿菌肽鋅和β-葡聚糖效果是相當(dāng)?shù)摹?/p>

4 結(jié) 論

① 飼糧中添加400 mg/kg的β-葡聚糖提高了斷奶仔豬的生長性能，降低了斷奶仔豬回腸和結(jié)腸中微生物氨基酸脫羧酶的活力。

② 飼糧中添加400 mg/kg的β-葡聚糖提高了斷奶仔豬結(jié)腸微生物相對豐度和有益菌相對豐度，并且降低了有害菌相對豐度。

③ β-葡聚糖在降低斷奶仔豬腸道微生物氨基酸脫羧酶活力和減少有害菌相對豐度方面與抗生素桿菌肽鋅沒有顯著性差異，在促進(jìn)腸道有益菌生長方面優(yōu)于桿菌肽鋅。