黃秀芳 原向偉 劉瓊?cè)?梁津杰 方曉華 蔡育波 楊文麗 黃 輝 陳艷虹 陳仙蘭張 鑫,3 林碧華

1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科，廣東江門 529030；2.廣東省江門市中心醫(yī)院脊柱骨科，廣東江門 529030；3.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；4.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞 523808

胃癌（gastric carcinoma）是常見的消化道惡性腫瘤，其中胃腺癌最為常見，可占85%以上[1-2]。世界新發(fā)胃癌的患者，一半以上位于我國(guó)[3]，由于早期癥狀不典型，普查不及時(shí)，我國(guó)早期胃癌的診斷率不足10%，5年生存率較低[4-5]，可見我國(guó)胃癌防治的嚴(yán)峻，深入研究胃癌的發(fā)生機(jī)制，尋找更為有效的診斷標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)意義重大。曲妥珠單抗（Trastuzumab）在人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）陽(yáng)性胃癌分子靶向治療過程中的療效已明確，熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization， FISH）技術(shù)是檢測(cè)HER-2/neu擴(kuò)增的金標(biāo)準(zhǔn)，也是重要的胃癌伴隨診斷項(xiàng)目[6]。雖然HER-2/neu擴(kuò)增可指導(dǎo)患者用藥，但HER-2/neu擴(kuò)增的胃癌患者中，其臨床病理特征及預(yù)后仍有爭(zhēng)論。本文利用癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）的數(shù)據(jù)和我院胃癌患者數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，探索HER-2/neu擴(kuò)增與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 TCGA胃腺癌數(shù)據(jù)下載

參考文獻(xiàn)[7-8]，在R語(yǔ)言軟件平臺(tái)（v3.2）上通過TCGAbiolinks程序的GDCquery函數(shù)下載癌癥基因組圖譜中胃腺癌的基因組拷貝數(shù)信息（由Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片過濾得到）及對(duì)應(yīng)樣品的臨床信息；利用GDCprepare_clinic函數(shù)輸出整理各患者的病理臨床信息。數(shù)據(jù)庫(kù)的更新下載日期為2018年5月31日，基礎(chǔ)信息較為完整的有效患者數(shù)為441例。

1.2 全基因組拷貝數(shù)變異分析

參考文獻(xiàn)[9-11]，在GenePattern公共服務(wù)器平臺(tái)（https：//genepattern.broadinstitute.org/），利用 GISTIC 2.0軟件分析各組腫瘤樣品的全基因組拷貝信息，參考基因組為人類19版基因組（human genome 19，hg19），探針標(biāo)記的物理位點(diǎn)信息（Markers file）和CNV參照信息（CNV file）均整理自SNP Array 6.0的第 35版本信息（http：//www.affymetrix.com/）；關(guān)鍵的運(yùn)行參數(shù)均為默認(rèn)，并分析HER-2/neu基因（ERBB2）的拷貝數(shù)變異情況。

1.3 臨床資料

選擇2008年1月～2014年12月，在我院進(jìn)行手術(shù)切除的胃癌標(biāo)本404例，術(shù)前或活檢前均未接受放、化療及免疫治療，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)明確診斷為胃腺癌。三組數(shù)據(jù)集的一般臨床病理信息比較見表1。

1.4 FISH法檢測(cè)HER-2/neu基因擴(kuò)增水平

HER-2/neu基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州達(dá)安基因股份有限公司（國(guó)械注冊(cè)20153402099），操作步驟及判讀標(biāo)準(zhǔn)參考說明書。根據(jù)病理醫(yī)師選定的檢測(cè)區(qū)域在蠟塊上做標(biāo)記，按4.0μm石蠟切片，65℃烤片1h；二甲苯室溫脫蠟，逐級(jí)酒精水化，超純水浸泡3min，沸水煮片20min；蛋白酶K反應(yīng)液覆蓋組織，37℃消化5min，過2×SSC緩沖液，逐級(jí)酒精脫水；探針雜交液覆蓋組織，加蓋蓋玻片，橡皮膠水封邊，85℃變性5min，37℃避光雜交過夜；孵育結(jié)束后，過2×SSC緩沖液，過0.1% NP-40/2×SSC緩沖液，70%乙醇脫水3min，滴加DAPI染液，加蓋蓋玻片，熒光顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，并參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，用Excel 2010及GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間頻數(shù)數(shù)據(jù)（2×2頻數(shù)表）統(tǒng)計(jì)使用χ2檢驗(yàn)（Chi-squared test）或Fisher’s精確檢驗(yàn)（Fisher’sexact test），生存分析使用Kaplan-Meier分析、Log-rank檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床病理信息比較

比較TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)與我院患者一般臨床病理信息，可知兩群患者在年齡（χ2=30.082，P＜ 0.001）、T分期（χ2=46.662，P＜0.001）和N分期（χ2=27.073，P＜0.001）的分布中有差異，在性別、病理分級(jí)、M分期及臨床分期中的分布無差異。

2.2 HER-2/neu基因擴(kuò)增情況

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，HER-2/neu基因擴(kuò)增65例，占全部患者的14.7%；我院HER-2基因擴(kuò)增69例，占全部患者的17.1%，兩組數(shù)據(jù)分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=0.865，P=0.352）。

2.3 HER-2/neu基因擴(kuò)增與胃癌臨床病理學(xué)特征間關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和我院樣品中，男性HER-2/neu擴(kuò)增率高于女性，差異均具顯著性（χ2=5.165，P=0.023及χ2=4.127，P=0.042）；低、中病理分級(jí)的 HER-2/neu

擴(kuò)增情況明顯高于高病理級(jí)別，差異均具顯著性（χ2=11.314，P＜0.001及χ2=7.121，P=0.008）。此外，不同年齡、T分期、N分期、M分期及臨床分期的胃癌HER2陽(yáng)性率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表2。在性別、年齡、病理分期及TNM分期中，HER-2/neu擴(kuò)增分布在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)與我院樣品間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的基本信息

表2 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的基本信息

2.4 HER-2/neu基因擴(kuò)增與胃癌患者預(yù)后間關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和我院胃癌患者生存曲線的對(duì)比，見圖1，其中HER-2/neu擴(kuò)增患者的中位生存時(shí)間是26.4個(gè)月和38.8個(gè)月，HER-2/neu非擴(kuò)增患者的中位生存時(shí)間是29.4個(gè)月和39.1個(gè)月，兩群患者的生存預(yù)后差異無顯著性（P=0.170和P=0.602）。

圖1 TCGA胃癌患者生存預(yù)后情況

3 討論

HER-2/neu的編碼基因（又稱 ERBB2），位于人染色體17q21，編碼185kD的I型跨膜酪氨酸激酶，其基因擴(kuò)增存在于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌和肺癌等惡性腫瘤[13-14]。HER-2/neu在胃癌及胃食管結(jié)合部癌的陽(yáng)性率為4.4%～53.4%，均值為17.9%[15]； TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，HER-2/neu的陽(yáng)性率為14.7%，我院樣品HER-2/neu的陽(yáng)性率為17.1%，兩組數(shù)據(jù)差異無顯著性，均符合文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]，表明國(guó)內(nèi)外胃癌中HER-2/neu的擴(kuò)增情況較為一致。

HER-2/neu的擴(kuò)增和過表達(dá)，可通過磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B， PKB，又 稱 Akt）及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPK）途徑影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、粘附、分化及浸潤(rùn)等[17]。乳腺癌中HER-2/neu的擴(kuò)增明確與差的病理臨床特征相關(guān)[13]，但在胃癌未見統(tǒng)一的結(jié)果。本研究顯示，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和我院樣品中，HER-2/neu的擴(kuò)增與患者的年齡、T、N、M分期及臨床分期均不相關(guān)，但男性患者HER-2/neu擴(kuò)增率高于女性；低病理級(jí)別胃癌HER-2/neu擴(kuò)增率顯著高于高級(jí)別的胃癌，表明HER-2/neu擴(kuò)增與男性及胃癌高分化程度相關(guān)，符合文獻(xiàn)報(bào)道[18]，提示男性、分化較好的胃癌是曲妥珠單抗治療的主要人群。

HER-2/neu擴(kuò)增是胃癌重要的預(yù)后因素，HER-2/neu擴(kuò)增患者的5年生存率較非擴(kuò)增低，是胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立檢測(cè)指標(biāo)[19]；也有文獻(xiàn)報(bào)道[20]，HER-2/neu的擴(kuò)增與患者總生存時(shí)間及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間均無關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)HER-2/neu的擴(kuò)增情況不能區(qū)分患者的總生存時(shí)間，表明在綜合臨床分期、病理分級(jí)和靶向HER-2藥物使用情況下，HER-2/neu的擴(kuò)增不能作為判斷患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。是否在特定臨床分期、病理分級(jí)及治療手段下，HER-2/neu的擴(kuò)增能作為胃癌患者預(yù)后判斷指標(biāo)，這需要我們進(jìn)一步的研究。