孫文斌， 黃小京， 馮蓓蓓， 湯夏安， 駱海玉， 鄧志勇， 鄧業(yè)成

(珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541006)

長期以來，植物病害的防治主要依賴化學(xué)藥劑。但由于病原菌抗藥性的產(chǎn)生，化學(xué)藥劑防效大大下降，并且嚴(yán)重污染環(huán)境和農(nóng)副產(chǎn)品，危害人畜健康，因此篩選植物內(nèi)生有益微生物來防治植物病害成為研究熱點(diǎn)[1]。植物內(nèi)生真菌(endophytic fungi)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部，而不使宿主植物出現(xiàn)明顯感染病害的真菌[2]。該類真菌具有促進(jìn)宿主生長[3-4]、提高宿主抗病[5-6]、抗脅迫[7-8]及他感能力[9]等作用，為尋找綠色環(huán)保的微生物源農(nóng)藥提供了新的資源。

地楓皮(Illiciumdifengpi)別稱楓榔、矮頂香，為木蘭科八角屬植物，是廣西巖溶石灰?guī)r石山一種特有的中藥材[10]，屬國家Ⅲ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)珍稀瀕危植物[11]。地楓皮是一種廣西特色壯藥，其莖皮和根皮具有祛風(fēng)除濕，行氣止痛等功效，臨床常用于風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、腰肌勞損和跌打損傷等癥狀治療，療效好，藥用價(jià)值高，是多種中成藥產(chǎn)品的主要原材料[12]。由于其分布區(qū)狹窄，野生資源蘊(yùn)藏量少，加上其生存環(huán)境惡化及多年來產(chǎn)區(qū)群眾亂采濫挖，種群數(shù)量越來越少，在很多地段瀕臨滅絕或已絕跡。到目前為止，國內(nèi)外對(duì)地楓皮內(nèi)生真菌的研究尚屬空白，使地楓皮內(nèi)生菌資源未能得到開發(fā)利用。本研究在2017年3月采自中國科學(xué)院廣西植物研究所的地楓皮根中分離鑒定內(nèi)生真菌，并對(duì)其生物學(xué)特性和生防價(jià)值進(jìn)行初步研究，旨在為地楓皮內(nèi)生真菌在農(nóng)用抗菌劑領(lǐng)域的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。整個(gè)試驗(yàn)全部在廣西師范大學(xué)珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 地楓皮(Illiciumdifengpi)植株采自中國科學(xué)院廣西植物研究所。

1.1.2 供試菌株 8種農(nóng)業(yè)重要植物病原真菌：玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)、茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)、甘藍(lán)黑斑病菌(Alternariaoleracea)、甘蔗鳳梨病菌(Ceratocystisparadoxa)、貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichumcapsici)、水稻胡麻葉斑病菌(Cochliobolusmiyabeanus)、煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)。貢柑鏈格孢菌(Alternariacitri)由廣西特色作物研究院提供，其余全部由廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理室提供。

1.2 方法

1.2.1 地楓皮內(nèi)生真菌DFP-G-7的分離純化 取地楓皮的健康地下根組織，先用流水沖洗干凈表面的泥土，切2 cm小段，無菌水漂洗3次，75%乙醇浸泡3 min，2%次氯酸鈉浸泡2 min，75%乙醇浸泡5 min，無菌水漂洗3次，將處理好的小段放置在已滅菌的PDA平板上，暗培養(yǎng)5～7 d后，挑取組織周邊的菌絲進(jìn)行純化，直到最終純化得到單一菌株為止。消毒可靠性檢驗(yàn)：用組織印跡法和最后一次的漂洗液檢查消毒效果。具體操作步驟：用滅菌鑷子夾住已消毒過的地楓皮根段，使其表面分別與PDA平板接觸3 min后取出，放置于與內(nèi)生真菌分離平板相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長。取最后一次的漂洗液100 μL，添加到已滅菌的PDA平板上，用涂布棒涂布均勻，放置于與內(nèi)生真菌分離平板相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長。

1.2.2 地楓皮內(nèi)生真菌DFP-G-7的鑒定 采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)具有顯著抗植物病原真菌活性的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行鑒定。形態(tài)鑒定主要根據(jù)其菌落形態(tài)、菌絲及孢子特征，對(duì)其進(jìn)行初步鑒定。分子鑒定主要利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)段的特性，即具保守性序列和特異性序列的特性，通過內(nèi)生真菌的rDNA-ITS序列對(duì)其進(jìn)行鑒定。采用十六烷基三甲基溴化銨法(CTAB)提取內(nèi)生真菌的總DNA，以真菌通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行18S rDNA擴(kuò)增，最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并純化，并由北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序得到的結(jié)果進(jìn)行校對(duì)拼接后登錄GenBank進(jìn)行全序列比對(duì)(Blast)，找出相似性最高、親緣關(guān)系最近的真菌作為參考序列，并用MEGA 7.0.26軟件和Clustalx 1.83軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 地楓皮內(nèi)生真菌DFP-G-7的生物學(xué)特性

1.2.3.1 不同溫度對(duì)菌絲生長的影響 將內(nèi)生真菌DFP-G-7活化后，用0.4 cm灼燒后滅菌的打孔器在其邊緣打出直徑0.4 cm的菌落，接種到PDA平板上，分別放到5、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3.2 不同碳源對(duì)菌絲生長的影響 不同碳源培養(yǎng)基為配方改良的PDA培養(yǎng)基，將不同碳源包括甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖、淀粉、麥芽糖替代葡萄糖，制備不同碳源培養(yǎng)基，碳源添加量為20 g/L，接種菌株DFP-G-7后(接種方法同“1.2.3.1”節(jié))，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3.3 不同氮源對(duì)菌絲生長的影響 氮源培養(yǎng)基為改良PDA培養(yǎng)基，添加氮源為2 g/L。供試氮源為酵母膏、甘氨酸、蛋白胨、硝酸鈣、硫酸銨、硝酸銨，制備不同氮源培養(yǎng)基，將DFP-G-7接種到平板上(接種方法同“1.2.3.1”節(jié))，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)重復(fù)處理3次。

1.2.3.4 不同pH值對(duì)菌絲生長的影響 用1 mol/L的鹽酸和氫氧化鈉將PDA培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)制4、5、6、7、8、9、10，接種DFP-G-7菌菌落到改良的PDA平板上(接種方法同“1.2.3.1”節(jié))，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.2.4 地楓皮內(nèi)生真菌DFP-G-7對(duì)植物病原菌的抑制作用 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法[13]，測(cè)定菌株DFP-G-7對(duì)8種植物病原菌的抑制活性，具體方法如下：將活化好的內(nèi)生真菌和植物病原菌，用無菌打孔器分別在內(nèi)生真菌和病原菌菌落邊緣切取大小為0.4 cm的圓形菌餅，置于同一PDA平板培養(yǎng)基中，內(nèi)生真菌和病原菌的菌絲塊處在同一直線的兩點(diǎn)上，且兩點(diǎn)相距4 cm。在平板背面標(biāo)記好相對(duì)應(yīng)的菌落名稱、日期等。

對(duì)照試驗(yàn)：同時(shí)以在另一個(gè)空白平板的相同位置只接種病原菌作為空白對(duì)照，且處理和對(duì)照均設(shè)3個(gè)重復(fù)。于26 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3～7 d，同時(shí)每天觀察處理組和對(duì)照組病原菌菌落以及菌絲生長速度、菌落之間是否有抑菌帶出現(xiàn)、菌落邊緣菌絲是否有稀疏和萎縮畸形等現(xiàn)象發(fā)生。待病原菌的菌落不再擴(kuò)大時(shí)用刻度尺測(cè)量處理組病原菌菌落生長半徑r病和對(duì)照組病原菌生長半徑r0。抑菌率計(jì)算公式：

抑菌率=(r0-r病)/r0×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)軟件 試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析(Duncan’s)，GraphPad Prism軟件作圖，MEGA 7.0.26軟件和Clustalx 1.83軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DFP-G-7的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.1.1 DFP-G-7形態(tài)學(xué)特征 該菌菌落生長較快，9 d菌落直徑可達(dá)到5.86 cm，菌絲表面為白色，邊緣整齊，背面淡米黃色，不透明，無水溶性色素，較易挑取。分生孢子很豐富，大分生孢子鐮刀形，4隔，長度在27.46 μm左右，小分生孢子近圓形。菌絲有隔，分生孢子梗有分支。初步鑒定為子囊菌綱肉座菌目叢赤殼科鐮刀菌屬真菌(圖1)。

2.1.2 DFP-G-7系統(tǒng)發(fā)育分析 通過18S rDNA的ITS序列對(duì)DFP-G-7進(jìn)行鑒定。將測(cè)序得到的結(jié)果在NCBI經(jīng)過Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其ITS序列和Fusariumnematophilum的相似性最高，相似度達(dá)到99%，在GenBank中的登錄號(hào)為KX171631。在Blast比對(duì)結(jié)果中選取相似度較高的幾組序列，應(yīng)用Clustalx 1.83軟件對(duì)序列進(jìn)行完全比對(duì)并將序列對(duì)齊，用MEGA 7.0軟件采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展檢驗(yàn)(Bootstrap)重復(fù)1 000次獲得的數(shù)值標(biāo)記在分支上(圖2)。由圖2可知，DFP-G-7和F.nematophilum以99%的可信度聚在同一分支上，與經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果分析，將該內(nèi)生真菌DFP-G-7鑒定為鐮孢屬真菌F.nematophilum。

2.2 地楓皮內(nèi)生真菌DFP-G-7的生物學(xué)特性

2.2.1 不同碳源對(duì)DFP-G-7生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，經(jīng)6種不同的碳源培養(yǎng)9 d后，該菌株能夠較好地利用這6種碳源，其中，對(duì)甘露醇的利用率最高，對(duì)乳糖的利用率最低(圖3)。該菌對(duì)碳源的要求并不嚴(yán)格，6種碳源并沒有顯著表現(xiàn)出對(duì)該菌的抑制或者促進(jìn)生長，但可以看出甘露醇為該菌生長的最佳碳源。

2.2.2 不同氮源對(duì)DFP-G-7生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，經(jīng)6種不同氮源培養(yǎng)9 d后，6種氮源中無論是有機(jī)氮，還是無機(jī)氮，對(duì)于DFP-G-7的生長影響均較小(圖4)，說明DFP-G-7對(duì)于氮源的要求較低，在有機(jī)氮和無機(jī)氮中都可以正常生長。

2.2.3 不同溫度對(duì)DFP-G-7生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)置7個(gè)溫度梯度，分別是5、10、15、20、25、30、35 ℃，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱9 d。由圖5可知，在10～30 ℃之間，DFP-G-7菌落均可以生長，25 ℃時(shí)生長最好，菌落直徑可以達(dá)到5.63 cm。該菌在5、35 ℃基本不生長。

2.2.4 不同pH值對(duì)DFP-G-7生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別用1 mol/L的HCl和NaOH溶液設(shè)置7個(gè)pH值，分別是4、5、6、7、8、9、10。由圖6可知，該菌在pH值為4～10之間均可生長，在偏酸性的環(huán)境下生長較慢，受到一定程度的抑制作用，在中性偏堿性的條件下，菌絲生長旺盛，在pH值為7時(shí)菌落直徑達(dá)到生長最大值，為5.83 cm，說明該菌適宜在中性環(huán)境中生長。

2.3 地楓皮內(nèi)生真菌DFP-G-7對(duì)植物病原菌的抑制作用

采用平板對(duì)峙法對(duì)8株常見的植物病原真菌進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果(表1)表明，內(nèi)生真菌DFP-G-7對(duì)8株常見的植物病原真菌有不同程度的抑制作用，其中對(duì)茶輪斑病菌、辣椒炭疽病菌和甘藍(lán)黑斑病菌的拮抗作用大，抑制率達(dá)到44.28%～50.64%，對(duì)煙草黑脛病菌的拮抗作用最小，抑制率只有11.45%。

表1 DFP-G-7對(duì)8株植物病原菌的拮抗作用

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在0.05水平上有顯著性差異。

3 討論

目前有關(guān)廣西特色壯藥地楓皮內(nèi)生真菌的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)首次對(duì)地楓皮內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定并對(duì)其抑菌活性和生物學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。通過組織分離法，從地楓皮的根、莖、葉中共分離得到內(nèi)生真菌30株。通過平板對(duì)峙法對(duì)其中20株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌活性篩選，篩選得到DFP-G-7對(duì)8種植物病原菌有較廣譜抑菌活性，其余10株未進(jìn)行篩選的原因是其生長速度緩慢，不適合該方法。以上研究結(jié)果表明，廣西特色壯藥地楓皮植株中存在具有顯著、廣譜抗菌活性的內(nèi)生真菌，從廣西特色壯藥地楓皮中分離和篩選具有抗菌活性的內(nèi)生真菌對(duì)生防菌株的發(fā)現(xiàn)和生物源殺菌劑的開發(fā)利用將具有十分重要的意義。

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)手段對(duì)內(nèi)生真菌DFP-G-7進(jìn)行鑒定，從形態(tài)學(xué)上可以看出其大分生孢子為鐮刀形并且有4～5個(gè)隔，又經(jīng)18S rDNA測(cè)序得到1條長度為549 bp的片段，在NCBI經(jīng)Blast比對(duì)其與F.nematophilum的相似度為99%，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹可知其與F.nematophilum在同一分支的支持率為99%，故將其歸為鐮刀屬(Fusarium)的真菌F.nematophilum。鐮刀屬真菌是常見的植物內(nèi)生真菌，具有多種活性成分，在植物中廣泛存在，并不引起植株組織病害。Tayung等從紅豆杉樹皮中分離到1株具有抑菌作用的腐皮鐮刀菌[14]；Barik等從菖蒲根中分離到1株內(nèi)生尖孢鐮刀菌，對(duì)臨床病原菌具有很好的抑制作用[15]。

通過對(duì)DFP-G-7生物學(xué)特性的研究表明，DFP-G-7對(duì)碳源和氮源影響并不敏感。溫度對(duì)DFP-G-7的生長的影響較大，其最適宜生長的溫度為25 ℃，在5 ℃和35 ℃均處于不生長的狀態(tài)。DFP-G-7對(duì)酸堿度的適應(yīng)能力較強(qiáng)，在pH值6～10范圍內(nèi)均能生長良好，pH值4～5范圍內(nèi)生長較差。

本試驗(yàn)只對(duì)DFP-G-7的種屬關(guān)系與生物學(xué)特性和抑菌活性進(jìn)行了研究，這僅是為以后的工作打下基礎(chǔ)，今后將對(duì)其次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行深入研究，通過活性追蹤分離出主要的抑菌活性物質(zhì)并探明其抑菌機(jī)制。