倪 賽, 劉銀春, 李 健, 李肖鶴, 朱向東
(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,江西南昌 330045)
微生物產(chǎn)品被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥生產(chǎn)、環(huán)境修復(fù)、日常用品等各方面。為滿足人類大量需求,研究新的微生物品種已成為微生物應(yīng)用的關(guān)鍵[1]。由微生物產(chǎn)生的抗生素類藥物是微生物誘變育種技術(shù)在制藥領(lǐng)域中的重要應(yīng)用[2]。面對(duì)抗生素的產(chǎn)生很難通過(guò)單個(gè)編碼基因或表達(dá)調(diào)控因子的改變而達(dá)到理想的效果這一現(xiàn)狀,傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)可以通過(guò)簡(jiǎn)便快速的誘變及適當(dāng)?shù)暮Y選手段而獲得生產(chǎn)性能優(yōu)良的工業(yè)菌株。因此,傳統(tǒng)的誘變育種技術(shù)在目前抗生素產(chǎn)生菌的選育過(guò)程中具有不可取代的地位[3]。除此之外,誘變育種技術(shù)對(duì)產(chǎn)抗生素微生物而言具有提高產(chǎn)量、提高純度、改進(jìn)發(fā)酵工藝和產(chǎn)生新抗生素等優(yōu)點(diǎn)[4]。直接從自然界中分離得到的野生型菌株性狀不穩(wěn)定,容易退化,無(wú)法滿足實(shí)際需求,這就須要利用育種方法對(duì)它們進(jìn)行改造[5]。微生物誘變育種通過(guò)改變微生物的遺傳結(jié)構(gòu)和功能,篩選出優(yōu)良的突變型微生物。這種育種方式使微生物變異速度快、效率高,是食品加工和醫(yī)藥生產(chǎn)等工業(yè)的首選[6]。目前,微生物誘變技術(shù)在制藥中的研究主要以獲得高產(chǎn)突變株為目的,通過(guò)誘變使酶活性極大提高,被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、生物農(nóng)藥及食品化妝品等方面[2]。在霉菌中,因其種類繁多、分布廣泛,又有菌絲和孢子等獨(dú)有特性,故誘變育種具有比較獨(dú)特的特點(diǎn)[7]。除此之外,多種物理誘變和化學(xué)誘變方法的結(jié)合使用,在霉菌中產(chǎn)生了很好的效果,特別是物理誘變方法中的紫外線誘變和化學(xué)誘變方法中的氯化鋰誘變相結(jié)合的運(yùn)用較多[2]。如張建勇等分別采用紫外線單因子誘變、紫外線-LiCl復(fù)合誘變處理藤黃灰鏈霉菌,致使其新型抗生素藤黃灰鏈霉菌素產(chǎn)量提高1.2倍[8]。此外,曹燕妮等以豌豆根瘤菌為出發(fā)菌株,利用紫外-LiCl-超聲波復(fù)合誘變,以期獲得高產(chǎn)輔酶Q10菌株[9]。
目前,人工誘變的育種方式主要包括物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變[7],在微生物育種中較常見(jiàn)的為物理誘變和化學(xué)誘變。此外應(yīng)用較多的還有復(fù)合誘變,通常僅采用一種方法進(jìn)行誘變,會(huì)使微生物產(chǎn)生抗性,從而降低突變率,復(fù)合誘變具有補(bǔ)充不同誘變方法之間缺陷的優(yōu)勢(shì)[6]。本研究主要運(yùn)用紫外誘變、紫外-LiCl復(fù)合誘變、紫外-亞硝酸復(fù)合誘變、微波誘變以及微波-超聲波-3%硫酸二乙酯(diethyl sulfate,簡(jiǎn)稱DES)復(fù)合誘變等技術(shù)對(duì)桔青霉(Penicilliumcitrinum)PA-33菌株孢子進(jìn)行誘變育種,由此獲得高產(chǎn)抗生素突變菌株,以期為桔青霉PA-33菌株工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。
桔青霉PA-33;病原菌:大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。以上菌株保存于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200 g/L、葡萄糖 20 g/L、水1 L、瓊脂15~20 g/L,pH值自然。
馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB):馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L、水1 L,pH值自然。
1.3.1 孢子懸液的制備 將菌株P(guān)A-33活化后加入適量無(wú)菌生理鹽水,洗下孢子,用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾除去菌絲體和培養(yǎng)基殘?jiān)?,裝入帶有玻璃珠的100 mL錐形瓶中,并置于搖床上振蕩30 min,使孢子充分分散,調(diào)整孢子懸液濃度為 106個(gè)/mL,備用。
1.3.2 紫外誘變處理 (1)在9個(gè)放置有無(wú)菌磁棒的培養(yǎng)皿中分別加入8 mL孢子懸液;(2)將培養(yǎng)皿放置在事先預(yù)熱20 min的15 W紫外燈下,照射距離為24 cm;(3)在磁力攪拌器上打開(kāi)皿蓋,分別照射0 s、30 s、60 s、90 s、2 min、4 min、6 min、9 min、15 min;(4)吸取處理后的孢子懸液1 mL依次進(jìn)行10倍稀釋,吸取10-2、10-3、10-4等3個(gè)梯度孢子懸液 0.2 mL 涂平板,重復(fù)3次,28 ℃恒溫培養(yǎng)3~5 d,根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算致死率,選擇致死率為90%左右的條件作為紫外誘變的最適條件;(5)誘變菌株初篩:采用致死率為90%的條件誘變,挑取菌落生長(zhǎng)速度快且菌落直徑大的單菌落,進(jìn)行復(fù)篩;(6)將初篩的菌株分別接種至PDB培養(yǎng)基中,置于28 ℃、150 r/min 的搖床上培養(yǎng)7 d,以大腸桿菌為指示菌,以原始菌株P(guān)A-33為對(duì)照,采用管碟法測(cè)定各突變菌株發(fā)酵液的抑菌圈直徑,根據(jù)抑菌圈直徑增加的大小確定最佳突變菌株。
1.3.3 紫外-LiCl復(fù)合誘變處理 將紫外誘變致死率為90%的孢子懸液依次稀釋10倍,選取10-2、10-3、10-4稀釋度的孢子懸液200 μL涂布于含LiCl濃度為0、0.3%、0.6%、1.0%、1.5%、2.0%的PDA平板中,每組重復(fù)3次,參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。
1.3.4 紫外-亞硝酸復(fù)合誘變處理 (1)將菌株P(guān)A-33參照紫外誘變致死率為90%的條件處理;(2)在每個(gè)試管中分別加入1 mL 0.2 mol/L NaNO2溶液、2 mL孢子懸液、1 mL pH值為4.5的醋酸緩沖液,充分混勻后,置于27 ℃水浴鍋中分別處理0、5、10、15、20、30、45、60 min,并加入2 mL 0.07 mol/L pH值為8.6的Na2HPO4溶液,每組重復(fù)3次。參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。
1.3.5 微波誘變處理 (1)火力強(qiáng)度的確定:分別吸取8 mL菌株P(guān)A-33孢子懸液于3個(gè)培養(yǎng)皿中,在不加蓋條件下,分別用額定功率700 W、頻率22 kHz的低火、中火、高火處理 20 s,吸取處理后的孢子懸液1 mL進(jìn)行10倍稀釋,吸取10-2、10-3、10-43個(gè)稀釋度的孢子懸液200 μL涂布于盛有PDA的平板中,重復(fù)3次,28 ℃恒溫培養(yǎng)3~5 d,記錄菌落數(shù)確定微波誘變火力強(qiáng)度。(2)致死率試驗(yàn):使用最合適的火力強(qiáng)度進(jìn)行微波誘變?cè)囼?yàn),分別吸取8 mL孢子懸液至平板中,微波爐中分別低火處理0、5、10、15、20、25、30、40、60 s,每組重復(fù)3次。參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。
1.3.6 微波-超聲波-3%硫酸二乙酯(diethyl sulfate,簡(jiǎn)稱DES)復(fù)合誘變處理 (1)在50 mL錐形瓶中分別加入16 mL pH值為7的磷酸緩沖液、4 mL 突變菌株WB-6孢子懸液和0.6 mL DES(DES終濃度為3%),并在200 W、22 kHz超聲波冰水浴條件下分別處理0、3、6、9、15、25、40、60 min,每組重復(fù)3次。參照“1.3.2”節(jié)方法確定最佳突變菌株。
1.3.7 突變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn) 將各突變菌株連續(xù)傳代6代,測(cè)定其發(fā)酵液的抗菌活性。
1.3.8 突變菌株抗菌活性測(cè)試 利用管碟法,以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌為指示菌,測(cè)定突變菌株發(fā)酵液的抗菌活性。
2.1.1 紫外誘變致死率試驗(yàn) 由圖1可知,在紫外燈功率15 W、照射距離24 cm條件下,隨著誘變時(shí)間的增加,紫外誘變致死率逐漸增大,在1.5 min時(shí),致死率為76.92%,在 2 min 時(shí),致死率為96.70%,誘變時(shí)間超過(guò)9 min時(shí),致死率超過(guò)99.00%。因此,選擇紫外誘變條件為紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間2 min。
2.1.2 紫外誘變突變菌株篩選 從平板上挑取44個(gè)菌落進(jìn)行復(fù)篩,結(jié)果顯示,紫外線對(duì)菌株P(guān)A-33誘變效果較差,僅有8個(gè)突變菌株的抑菌圈直徑增大,正向突變率僅為18.18%,其中突變菌株UV-22抑菌圈直徑最大,活性提高率卻僅為12.55%(表1)。
2.2.1 菌株P(guān)A-33紫外-LiCl復(fù)合誘變致死率試驗(yàn) 由圖2可知,菌株P(guān)A-33在紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間2 min的誘變條件下,隨著LiCl濃度的增加,其致死率整體增大,在LiCl濃度為0.6%時(shí),致死率為88.12%,LiCl濃度繼續(xù)增加到1.5%時(shí),致死率達(dá)100%。因此,確定紫外-LiCl復(fù)合誘變條件為紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間2 min、LiCl濃度為0.6%。
表1 紫外誘變復(fù)篩菌株及其抗菌活性
2.2.2 紫外-LiCl復(fù)合誘變突變菌株篩選 從平板上挑取28個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩,6個(gè)突變菌株抗菌活性增強(qiáng),正向突變率為21.43%。由表2可知,突變菌株Li-1的抑菌圈直徑最大,為26.13 mm;活性提高率最大,為39.51%。突變菌株 Li-13、Li-17、Li-19、Li-27、Li-28活性提高率分別為7.47%、3.58%、6.03%、11.05%、9.08%,其中突變菌株 Li-17 活性提高率最低,僅為3.58%。
表2 紫外-LiCl復(fù)合誘變復(fù)篩菌株及其抗菌活性
2.3.1 菌株P(guān)A-33紫外-亞硝酸復(fù)合誘變致死率試驗(yàn) 由圖3可知,菌株P(guān)A-33在紫外燈功率15 W、照射距離 24 cm、照射時(shí)間2 min誘變的基礎(chǔ)上,進(jìn)行亞硝酸誘變,亞硝酸濃度為0.2 mol/L條件下,隨著誘變時(shí)間的增加,其孢子致死率逐漸增大,當(dāng)誘變時(shí)間為30、45、60 min時(shí),孢子致死率分別為76.47%、91.18%、94.12%。因此,確定紫外-亞硝酸復(fù)合誘變條件為紫外燈功率15 W、照射距離24 cm、照射時(shí)間 2 min、0.2 mol/L亞硝酸作用時(shí)間45 min。
2.3.2 紫外-亞硝酸復(fù)合誘變突變菌株篩選 從平板上挑取41個(gè)突變菌株進(jìn)行復(fù)篩,其中11個(gè)突變菌株抗菌活性增強(qiáng),正向突變率為26.83%。由表3可知,突變菌株H-14和 N-25抑菌圈直徑最大,分別為26.27、26.07 mm,活性提高率分別為40.26%、39.19%。
2.4.1 微波誘變火力強(qiáng)度確定 將菌株P(guān)A-33孢子懸液分別經(jīng)微波低火、中火和高火處理20s,結(jié)果(表4)顯示,低火處理組存活的菌落數(shù)為6.5×104個(gè)/mL,而中火和高火處理組無(wú)存活菌落數(shù),因此選用低火作為微波誘變的火力強(qiáng)度。
表3 紫外-亞硝酸復(fù)合誘變復(fù)篩菌株及其抗菌活性
表4 微波火力強(qiáng)度對(duì)菌株P(guān)A-33孢子存活能力的影響
2.4.2 菌株P(guān)A-33微波誘變致死率試驗(yàn) 由圖4可知,菌株P(guān)A-33的孢子懸液經(jīng)功率為700 W、頻率22 kHz的微波低火處理時(shí),隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),其孢子致死率逐漸增加,處理時(shí)間為25 s時(shí),致死率為85.88%,處理時(shí)間為30 s時(shí),致死率已達(dá)到90.40%,處理60 s時(shí),致死率已接近97%。因此,確定微波誘變菌株P(guān)A-33的條件為微波爐功率700 W,頻率22 kHz,低火處理30 s。
2.4.3 菌株P(guān)A-33微波誘變突變菌株篩選 從平板上挑取39株突變菌株進(jìn)行發(fā)酵,抑菌活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表5。共有24株突變菌株發(fā)酵液抑菌圈直徑增強(qiáng),正向突變率為 61.54%,其中突變菌株WB-6抑菌圈直徑為25.40 mm,抗菌活性提高率最高,為32.29%。
表5 微波誘變復(fù)篩菌株及其抑菌活性
2.5.1 微波-超聲波-DES復(fù)合誘變致死率試驗(yàn) 微波誘變突變菌株WB-6孢子懸液經(jīng)超聲波聯(lián)合3%DES誘變處理不同時(shí)間。由圖5可知,隨著誘變時(shí)間的延長(zhǎng),其孢子懸液致死率不斷增加。當(dāng)處理時(shí)間為15 min時(shí),致死率已達(dá)到88.89%;當(dāng)處理時(shí)間為60 min時(shí),致死率達(dá)到98.77%。因此,確定超聲波-3%DES誘變條件為200 W、22 kHz超聲波強(qiáng)度、3%DES處理15 min。
2.5.2 微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變突變菌株篩選 挑取29株突變菌株用于抗菌活性測(cè)試,由表6可知,共有18株突變菌株發(fā)酵液抗菌活性增強(qiáng),正向突變率為62.07%,其中突變菌株D-11抑菌圈直徑為23.20 mm,抗菌活性提高率最大,達(dá)到20.83%。
由圖6可知,突變菌株Li-1、H-14、N-25的傳代穩(wěn)定性較好,傳代至6代抗菌活性基本穩(wěn)定。突變菌株WB-6、D-11的傳代穩(wěn)定性較差, 發(fā)酵液抑菌圈直徑總體呈下降趨勢(shì),突變菌株WB-6抗菌活性提高率維持在30.97%~32.29%,突變菌株D-11的抗菌活性提高率變化區(qū)間為 23.17%~28.51%。綜上,突變菌株Li-1、H-14、N-25是傳代穩(wěn)定性較好的菌株,突變菌株WB-6、D-11傳代穩(wěn)定性較差。
表6 微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變復(fù)篩菌株及其抑菌活性
與原始菌株P(guān)A-33發(fā)酵液抗菌活性相比,突變菌株 Li-1對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加5.53、9.80、6.53、7.40 mm;突變菌株H-14對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加4.66、7.54、5.20、7.54 mm;突變菌株N-25對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加4.33、9.07、5.73、7.34 mm;突變菌株WB-6對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加4.13、6.27、6.06、6.67 mm;突變菌株D-11對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌的抑菌圈直徑分別增加3.23、4.67、3.33、5.34 mm。其中突變菌株Li-1抗菌活性最大,突變菌株H-14、N-25、WB-6次之,D-11抗菌活性最小(表7)。
表7 突變菌株抗菌活性測(cè)試
分別采用紫外誘變、紫外-LiCl復(fù)合誘變、紫外-亞硝酸復(fù)合誘變、微波誘變以及微波-超聲波和3%DES復(fù)合誘變菌株P(guān)A-33,分別篩選得到抗菌活性提高最大的突變菌株 Li-1、N-25、H-14、WB-6、D-11,它們對(duì)大腸桿菌的抗菌活性分別提高39.51%、39.19%、40.26%、32.29%、20.83%。通過(guò)傳代穩(wěn)定性測(cè)試,突變菌株Li-1、H-14、N-25是傳代穩(wěn)定性較好的菌株,突變菌株WB-6、D-11傳代穩(wěn)定性較差。紫外單因子誘變突變菌株的活性提高率最高僅為12.55%,而在紫外誘變基礎(chǔ)上,進(jìn)行LiCl誘變后,抗菌活性明顯增強(qiáng),最高活性提高率增至 39.51%;同時(shí)在紫外誘變基礎(chǔ)上進(jìn)行亞硝酸誘變后,得到突變菌株N-25、H-14的抗菌活性明顯增強(qiáng),活性提高率分別增至39.19%、40.26%。紫外誘變對(duì)菌株P(guān)A-33的誘變效果較差,可能是因?yàn)樽贤饩€主要阻礙堿基間的正常配對(duì)和妨礙雙鏈的解開(kāi)而使菌株發(fā)生變異,其引起的突變單一[10],形成的突變體類型較少。而在紫外誘變基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行LiCl和亞硝酸誘變使得菌株P(guān)A-33產(chǎn)生高比例點(diǎn)突變和低比例的染色體畸變,從而使誘變效果增強(qiáng)。朱峰等分別使用3種復(fù)合誘變方法處理Snea253-GL 8菌株,篩選出高殺蟲(chóng)活性和穩(wěn)定高產(chǎn)的突變株[11]。韓娜應(yīng)用亞硝酸結(jié)合消泡劑誘變選育得到的9S-189菌株,該菌株能顯著提高對(duì)消泡劑的耐性并能夠更適應(yīng)高消泡劑的環(huán)境[12]。Xu等將StreptomycespristinaespiralisCGMCC 0957菌株經(jīng)紫外線誘變結(jié)合耐自身產(chǎn)物抗性篩選,獲得普納霉素高產(chǎn)菌株[13]。劉明志等以產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌葡萄座腔菌菌株J11為出發(fā)菌,經(jīng)甲基磺酸乙酯和制霉菌素復(fù)合誘變,得到誘變菌株J11-8,產(chǎn)紫杉醇量提高66.5%[14]。胡丹東等以產(chǎn)核酸酶P1桔青霉050421為出發(fā)菌株,經(jīng)紫外線誘變處理,其突變菌株050421-A產(chǎn)酶活性比出發(fā)菌株提高了約68.1%,同時(shí)將此菌株再經(jīng)過(guò)化學(xué)試劑LiCl處理,得到遺傳穩(wěn)定性較好的菌株050421-A-AB,其產(chǎn)酶活性在紫外誘變基礎(chǔ)上提高了40.05%,比原始出發(fā)菌株050421提高了約138.88%[15]。
微波誘變以及微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變效果相對(duì)較好,其中微波-超聲波-3% DES復(fù)合誘變效果明顯低于微波單因子誘變效果,突變菌株D-11的抗菌活性提高率明顯低于突變菌株WB-6,微波單因子誘變效果明顯,原因可能是以下3個(gè)方面[16]:(1)微波是一種電磁波,可使單孢子內(nèi)DNA分子氫鍵和堿基對(duì)及化學(xué)力受損,最終引起分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致遺傳變異;(2)微波極強(qiáng)的穿透效應(yīng),使細(xì)胞壁內(nèi)外的水分子產(chǎn)生劇烈運(yùn)動(dòng),從而改變細(xì)胞壁通透性,使胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái);(3)微波所產(chǎn)生的瞬時(shí)熱效應(yīng),易引起酶失活,從而造成細(xì)胞的生理、生化變異和微生物的動(dòng)態(tài)代謝平衡發(fā)生紊亂,從而改變其代謝途徑。鮑勇陽(yáng)等采用微波-DES復(fù)合誘變,以產(chǎn)淀粉酶黑曲霉為出發(fā)菌株,得到的突變株再經(jīng)發(fā)酵優(yōu)化后,其α-淀粉酶的酶活性最高達(dá)到 6 011 U/g[17]。蘇龍等以產(chǎn)核酸酶P1桔青霉為出發(fā)菌株,通過(guò)微波誘變,得到1株產(chǎn)核酸酶較高的生產(chǎn)菌SL5,其產(chǎn)生的核酸酶P1酶活性提高了84.00%[18]。田利飛等以YC34菌株為出發(fā)菌株,通過(guò)紫外誘變、微波誘變、LiCl誘變3種方式依次進(jìn)行復(fù)合誘變處理后,獲得突變株YC34-1,其初發(fā)酵液的酶活性增加了183.3%[19]。