周光姣，白 華，權(quán)春梅，汪盈盈,黃 翔

(1.安徽中醫(yī)藥科學(xué)院 亳州中醫(yī)藥研究所，安徽 亳州 230031；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800)

中藥化學(xué)成分眾多、復(fù)雜，且中醫(yī)藥理論強(qiáng)調(diào)成分的整體協(xié)同作用，故對(duì)藥材及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)慢慢由單一成分評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)向多指標(biāo)、整體性評(píng)價(jià)。一測(cè)多評(píng)法(QAMS)是利用樣品中物質(zhì)含量與檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)值的比例關(guān)系，選擇并測(cè)定一個(gè)成分，以該成分作為內(nèi)參物，通過方法學(xué)考察，建立內(nèi)參物與其他物質(zhì)間的檢測(cè)響應(yīng)值比例關(guān)系即相對(duì)校正因子，利用相對(duì)校正因子換算其他物質(zhì)的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)其中多個(gè)成分含量的測(cè)定[1-3]。一測(cè)多評(píng)法可以實(shí)現(xiàn)多種成分的同步測(cè)定，提高工作效率，還可以解決缺乏對(duì)照品的問題，能夠最大限度降低檢驗(yàn)成本。

白芍為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall)的干燥根，性微寒，味微苦、酸。具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛、斂陰止汗等功效，臨床上廣泛應(yīng)用[4]。白芍主產(chǎn)于安徽、浙江、四川等地，其中安徽亳州種植面積最大，產(chǎn)量最大，也是白芍的地道產(chǎn)地。目前，對(duì)白芍中的化學(xué)成分和含量測(cè)定方法已研究較多，但運(yùn)用一測(cè)多評(píng)法研究、評(píng)價(jià)白芍的質(zhì)量相對(duì)較少[5]。本課題采用一測(cè)多評(píng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式，以芍藥苷為內(nèi)參物，利用相對(duì)校正因子計(jì)算白芍中沒食子酸、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量，以更簡(jiǎn)單的方法，多指標(biāo)評(píng)價(jià)白芍的質(zhì)量，使其更加合理、可行。

1 儀器設(shè)備與材料

1.1 儀器設(shè)備

Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Agilent ChemStation工作站；島津 LC-20A 高效液相色譜儀，Lab solution工作站；Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、安捷倫ZORBAXSBC18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱；FA2204電子天平(常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司)等。

1.2 材料

樣品：實(shí)驗(yàn)用藥材樣品為課題組成員分別從安徽、浙江、四川白芍主產(chǎn)區(qū)采集，經(jīng)亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院陳娜副教授鑒定為毛茛科植物芍藥(Paeonia lactiflora Pall)的根。具體信息見表1。

對(duì)照品：沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)：1110831-201204))、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：110736-201640)、苯甲酸對(duì)照品(批號(hào)：100419-201502)，購自中國藥品生物制品研究院；芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品(批號(hào)：17022404)、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)：20140419)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司。

試劑：甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC色譜條件

采用安捷倫ZORBAXSBC18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序見表2。進(jìn)樣量10 μL，柱溫28 ℃，流速1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

表1 藥材樣品信息表(n=6)

表2 洗脫程序

此色譜條件下沒食子酸、苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和苯甲酸分離效果較好，理論塔板數(shù)不低于4000。結(jié)果見圖1。

2.2 樣品溶液的制備

稱取白芍樣品1 g，粉碎過2號(hào)篩，精密稱定，加入20 mL 70%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并濾液，70%乙醇定容至100 mL，搖勻，微孔濾膜濾過，即得樣品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品13.75 mg、芍藥苷對(duì)照品22.21 mg、苯甲酰芍藥苷對(duì)照品10.64 mg和苯甲酸對(duì)照品6.6 mg、精密移取沒食子酸母液(精密稱定沒食子酸對(duì)照品15.88 mg，甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻作為沒食子酸母液)2.5 mL至50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度50 mL，得到芍藥內(nèi)酯苷濃度為275 μg/mL、芍藥苷濃度為444.2 μg/mL、苯甲酰芍藥苷212.8 μg/mL、苯甲酸132 μg/mL、沒食子酸濃度為79.4 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系的考察

精密移取上述混合對(duì)照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL分別至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，制成不同濃度的對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，線性回歸，得回歸方程見表3。

1.沒食子酸 2.芍藥內(nèi)酯苷 3.芍藥苷 4.苯甲酸 5.苯甲酰芍藥苷?qǐng)D1 白芍樣品和混合對(duì)照品的HPLC圖

成分回歸方程r線性范圍μg/mL沒食子酸y=19.018x+45.5220.99983.97～39.7芍藥苷y=3.4082x+37.8910.999622.21～222.1芍藥內(nèi)酯苷y=1.8036x+25.2480.9998 13.75～137.5苯甲酰芍藥苷y=4.6754x-10.0720.9994 10.64～106.4苯甲酸y=25.378x+15.142 0.99966.6～66

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

稱取安徽亳州十八里鎮(zhèn)白芍樣品1.0 g，按分2.2項(xiàng)下制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液10 μL。按上述色譜條件，進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，重復(fù)6次。分別記錄沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷和芍藥苷的6次峰面積，計(jì)算其RSD分別為1.32%、1.78%、1.41%、0.93%、1.48%，結(jié)果表明所使用設(shè)備精密度較好。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分別取安徽亳州十八里鎮(zhèn)的白芍樣品6份，按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液，按上述色譜條件，測(cè)定苯甲酰芍藥苷、苯甲酸、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和沒食子酸的含量，計(jì)算RSD分別為1.21%、1.58%、1.31%、0.98%、1.07%，均小于2%，表示該方法重復(fù)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取十八里鎮(zhèn)的白芍樣品按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液，按上述色譜條件，分別于0、3、6、9、12、18、24、48h進(jìn)樣。記錄苯甲酰芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、芍藥內(nèi)酯苷和沒食子酸的峰面積，算得RSD分別為1.19%、0.82%、1.22%、1.81%、1.73%，均小于2%，表明樣品溶液在48 h內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知樣品含量的白芍樣品6份(苯甲酸芍藥苷含量為0.138%、沒食子酸含量為0.279%、苯甲酸含量為0.117%、芍藥苷含量為1.615%、芍藥內(nèi)酯苷含量為0.549%)，粉碎，過2號(hào)篩，每份取0.5 g，精密稱定，分別按80%、100%、120% 三個(gè)水平，加入苯甲酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和沒食子酸5種對(duì)照品。按2.2項(xiàng)下制備樣品溶液，按上述色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果苯甲酸芍藥苷、沒食子酸、苯甲酸、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷苷的加樣回收率分別為101.5%、100. 4%、98.84%、99.27%和101.2%，RSD值分別為1.89%、1.72%、1.28%、0.84%和1.06%。

2.4.6 相對(duì)校正因子(RCF)和相對(duì)保留時(shí)間(RRT)的測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 mL,至10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，分別吸取10、20、30、40、50 μL按“2. 1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酸和苯甲酰芍藥苷峰面積。以芍藥苷為內(nèi)參物，計(jì)算沒食子酸(X1)、芍藥內(nèi)酯苷(X2)、苯甲酸(X3)和苯甲酰芍藥苷(X4)的相對(duì)校正因子(RCF)和相對(duì)保留時(shí)間(RRT)，結(jié)果見表4。表明使用不同色譜柱和不同高效液相色譜儀，各成分相對(duì)于芍藥苷的 RCF 值和 RRT 值的 RSD 均小于 5.0%，說明該方法重現(xiàn)性較好。

表4 白芍藥材中 4種成分的RCF和RRT(n=3)

2.5 QAMS法和外標(biāo)法5種成分含量測(cè)定結(jié)果和比較

分別取白芍樣品約1g，粉碎，過2號(hào)篩，精密稱定。分別按2.2項(xiàng)制備方法制備樣品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，采用外標(biāo)法和QAMS算出各白芍藥材中5種含量，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明：QAMS法和外標(biāo)法測(cè)定各批樣品中沒食子酸、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸5種成分含量結(jié)果相對(duì)誤差很小，均小于5%，表明兩種方法所測(cè)得含量無顯著差異。

3 討論

從表3方法耐用性考察結(jié)果可以看出，內(nèi)參物芍藥苷與沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸4種成分之間的相對(duì)校正因子重現(xiàn)性良好，說明QAMS法用于測(cè)定亳白芍中的5種成分，系統(tǒng)適用性強(qiáng)，方法具有可行性和可靠性。

白芍樣品的制備時(shí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)是分別摸索了回流提取和超聲提取兩種方法，并篩選了提取溶媒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取較回流提取工藝簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間和耗材，但所得提取液相色譜出峰數(shù)多、分離度不好，故選擇回流提取。在選擇40%、70%和80%三個(gè)濃度的乙醇做提取溶劑時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)40%乙醇5種成分的含量都偏低，70%、80%的乙醇，結(jié)果差異不大，但從節(jié)省資源的角度，優(yōu)選70%的乙醇做最后的提取溶劑。

表5 QAMS法和外標(biāo)法測(cè)定藥亳白芍材中5種成分含量結(jié)果及比較(%，n=3)

白芍藥材5種成分檢測(cè)，一測(cè)多評(píng)法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的外標(biāo)法，在沒食子酸、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷和苯甲酸對(duì)照品缺乏的情況下可以實(shí)現(xiàn)多成分的檢測(cè)，同時(shí)還節(jié)約了檢測(cè)成本，值得推廣應(yīng)用。