魏 威，余 江，王亞婷，陶紅群，鄧思維，冉宗信

1)四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，四川成都 610065； 2)四川大學(xué)新能源與低碳技術(shù)研究院，四川成都 610065；3)成都市環(huán)境保護(hù)科學(xué)研究院，四川成都610072

土壤具有緩沖和凈化功能，是人類生存的重要保障. 但隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人類活動(dòng)給土壤環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重危害. 重金屬作為一類持久且不易降解的污染物，威脅著地下水安全、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及人類健康[1]. 在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)，全球約有2.20×104t的鉻、9.39×105t的銅、7.83×105t的鉛和1.35×105t的鋅被排放到環(huán)境中，有很大部分進(jìn)入了土壤[2]. 中國(guó)土壤受到重金屬污染的情形也同樣嚴(yán)峻，全國(guó)有超過(guò)1/6的耕地受到重金屬污染，累計(jì)污染面積達(dá)到200萬(wàn)km2[3]. 受到重金屬污染的糧食年平均量已達(dá)1 200萬(wàn)t，經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)200億元[4]. 與其他重金屬相比，鉛具有高溶解性、高生化活性和強(qiáng)致癌性的特點(diǎn)[5]. 鉛的攝入會(huì)導(dǎo)致人體腎臟、生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等出現(xiàn)問(wèn)題，另外鉛對(duì)兒童的傷害尤為明顯，主要損害兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)， 從而影響智力發(fā)育[6].

重金屬在自然條件下很難降解，目前對(duì)受到重金屬污染土壤采用的修復(fù)方法有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù). 其中，化學(xué)固定技術(shù)因在經(jīng)濟(jì)和時(shí)效性上具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)而得到廣泛應(yīng)用[7]. 化學(xué)固定技術(shù)主要依靠施加固定劑得以實(shí)現(xiàn)，固定劑能夠大幅降低重金屬的生物有效性和毒性，且操作簡(jiǎn)單、投資成本低[8-9]. 但常規(guī)固定劑的施加可能改變土壤理化性質(zhì)，不利于植物生長(zhǎng)[10]，而微生物具有改良土壤理化性質(zhì)的作用[11]. 將固定劑和微生物結(jié)合進(jìn)行固定化處理，不僅可有效固定重金屬，還可降低對(duì)土壤原生態(tài)系統(tǒng)的破壞，對(duì)重金屬污染土壤治理具有一定的現(xiàn)實(shí)意義，但相關(guān)研究鮮有報(bào)道. 為此，本研究采用沸石、硅藻土和有機(jī)改良膨潤(rùn)土對(duì)鉛污染土壤進(jìn)行固定化處理，篩選出固定效果最佳的沸石及對(duì)鉛具有固定作用的硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria，SRB)組成聯(lián)合固定體系，通過(guò)浸出毒性實(shí)驗(yàn)判斷其固定效果，為固定劑和微生物組配運(yùn)用于鉛污染土壤的修復(fù)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試土壤采自成都市雙流區(qū)某農(nóng)田，取0～20 cm表層土，土壤理化性質(zhì)如表1. 樣品自然風(fēng)干，去除草葉和石塊等雜物，用球磨機(jī)磨碎后過(guò)0.2 mm篩. 土壤樣品采用人工染毒方式對(duì)樣品鉛進(jìn)行加富處理. 即稱取3 kg風(fēng)干過(guò)篩土樣于水桶中，加入硝酸鉛溶液進(jìn)行染毒，并加入1 L蒸餾水，不斷攪拌30 min. 然后將土壤倒入托盤(pán). 放置在陰涼通風(fēng)處，自然風(fēng)干3～5 d，磨碎過(guò)2 mm篩，備用. 染毒后土壤中鉛(Pb)的實(shí)際質(zhì)量分?jǐn)?shù)為829.1 mg/kg. 浸出態(tài)Pb的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為132.1 mg/kg.

表1 土壤的理化性質(zhì)指標(biāo)測(cè)量結(jié)果Table 1 Measurement results of physical and chemical properties of soil

1.2 菌種培養(yǎng)

1)實(shí)驗(yàn)菌種.

有效微生物群菌(effective microorganisms，EM)是由光合細(xì)菌、乳酸菌和酵母菌等3大菌群70多種微生物組成，通過(guò)發(fā)酵工藝將上述好氧及厭氧微生物混合培養(yǎng)，形成相互生長(zhǎng)的基質(zhì)和原料，通過(guò)相互共生增殖關(guān)系，形成一個(gè)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、功能廣泛且具有多種多樣微生物群落的生物菌群. SRB為單一菌種，購(gòu)自長(zhǎng)征化玻試劑公司，采用改進(jìn)的波斯特蓋特氏(Postgate)培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng).

2)菌種的培養(yǎng).

本實(shí)驗(yàn)用EM菌為EM菌工作液，已含細(xì)菌所需的生長(zhǎng)條件，不需要再培養(yǎng)，可以直接加入到土壤中. 按照改進(jìn)的波斯特蓋特氏培養(yǎng)基的配方，配置好培養(yǎng)基，并在121 ℃ 蒸汽下滅菌20 min. 用前添加滅菌后質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的鹽酸半胱氨酸溶液，其最高濃度為5 μg/mL(保持厭氧). 之后將提純過(guò)的硫酸鹽還原菌，接種于液體培養(yǎng)基中. 置于恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d. 瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)出黑色群落時(shí)為培養(yǎng)成功，備用.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1)單一細(xì)菌固定化實(shí)驗(yàn).

取50 g制備好的土壤樣品，按表2接種微生物，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每克土壤樣品加入0.5 mL超純水，充分?jǐn)嚢瑁糜陉帥鐾L(fēng)處培養(yǎng)14 d，期間每天加水，保持田間持水量的70%. 其中，將含有SRB的土樣封口培養(yǎng)，隔絕氧氣. 14 d后，停止加水，自然風(fēng)干、磨碎、過(guò)篩，備用.

表2 實(shí)驗(yàn)樣品制備Table 2 Experimental sample preparation

2)固定劑篩選實(shí)驗(yàn).

取50 g制備好的土壤樣品，pH值約為7，分別按0、2、4、8和16 mg/g添加3種固定劑(沸石、硅藻土和有機(jī)改良膨潤(rùn)土)，保持固液比不變，充分?jǐn)嚢韬笾糜陉帥鐾L(fēng)處固定14 d，每組實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù). 用四分法獲取鈍化后的土壤，將其研磨后，過(guò)0.2 mm篩，待測(cè).

3)鈍化劑和微生物復(fù)配實(shí)驗(yàn).

取未添加有機(jī)質(zhì)的人工染毒土壤(pH值約為7)50 g，首先按照8 mg/g添加所篩選出的最佳固定劑，與土壤混合均勻，再加入菌液和20 mL超純水，充分?jǐn)嚢? 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，置于陰涼通風(fēng)處.為保持一定的持水量，每天加水2 mL左右，培養(yǎng)14 d. 自然風(fēng)干、磨碎、過(guò)篩，待測(cè).

4)分析方法.

土壤pH值采用酸度計(jì)測(cè)定，測(cè)定時(shí)，保持土水質(zhì)量比為1.0∶2.5，用磁力攪拌器攪拌5 min，靜置30 min后測(cè)定；通過(guò)電導(dǎo)儀測(cè)定土壤的電導(dǎo)率；采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法測(cè)定土壤的有機(jī)質(zhì)含量；采用凱氏定氮法利用消化爐和定氮儀測(cè)定全氮含量；采用消化法測(cè)定全磷含量；按照改進(jìn)的BCR連續(xù)提取法測(cè)定鉛總量.采用美國(guó)EPA的毒性特性浸出程序測(cè)定土壤在不同處理方式時(shí)鉛的浸出態(tài)濃度[12-14].

1.4 數(shù)據(jù)分析與質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次重復(fù)樣品數(shù)據(jù)的算術(shù)平均值，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和制圖采用Origin 9.1 軟件完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 單一細(xì)菌對(duì)土壤鉛的固定效果

EM菌和SRB分別對(duì)土壤鉛的浸出態(tài)含量影響結(jié)果見(jiàn)圖1. 由圖1可知，兩種微生物菌劑表現(xiàn)出完全不同的特性. 接種SRB后，土壤鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈下降趨勢(shì)，且隨接種菌液體積的增加，土壤鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷降低. 接種菌液體積為1 mL時(shí)，鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少了34.58%；接種菌液體積為4 mL時(shí)，鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少了38.32%. SRB是一種典型的還原細(xì)菌，去除重金屬離子的主要途徑體現(xiàn)在3個(gè)方面：① SRB利用自身表面的胞外聚合物吸附重金屬離子；② 利用硫離子對(duì)重金屬進(jìn)行還原或直接沉淀；③ 通過(guò)電子傳遞途徑還原高價(jià)態(tài)的重金屬離子[15]. 本實(shí)驗(yàn)SRB促進(jìn)Pb2+濃度降低的結(jié)果與韓劍宏等[16]研究機(jī)理一致，即Pb2+與S2-結(jié)合發(fā)生了共沉淀現(xiàn)象.

圖1 不同菌種對(duì)土壤鉛浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of different strains on leaching state of soil lead

EM菌的作用效果不同于SRB，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入的EM菌越多，鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之增多. 當(dāng)加入菌液體積為1 mL時(shí)，鉛金屬的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了4.67%；而當(dāng)接種體積達(dá)到4 mL時(shí)，土壤鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加了28.66%. 顯示EM菌對(duì)鉛不具有固定作用. 本研究采用的EM菌主要由光合細(xì)菌、乳酸菌和酵母菌組成，乳酸菌和酵母菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中，會(huì)分泌乳酸和乙酸等酸性物質(zhì)[17-18]，使土壤pH值降低，促進(jìn)了鉛離子的溶解，這可能是導(dǎo)致鉛浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的主要原因. 可見(jiàn)，EM菌對(duì)鉛實(shí)際上起到了活化作用，增加了其遷移性和生物利用性，不適合作為固定土壤鉛的微生物菌種.

2.2 復(fù)合細(xì)菌對(duì)土壤中鉛的固定效果

按質(zhì)量比1∶1接種EM菌和SRB，對(duì)土壤中鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響結(jié)果如圖2. 由圖2可知，同時(shí)接種EM菌和SRB，土壤中鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低，且隨接種量的增加，浸出態(tài)鉛的質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨之減少. 但復(fù)合細(xì)菌的處理效果遠(yuǎn)低于SRB單一菌劑. 當(dāng)接種復(fù)合細(xì)菌4 mL時(shí)，與空白對(duì)照組相比，鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅減少了35.98%；而接種SRB 1 mL時(shí)，土壤中鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少了34.58%. 可見(jiàn)，EM菌與SRB聯(lián)合作用，依舊對(duì)土壤中的鉛表現(xiàn)出一定的固定作用，但EM菌降低了SRB的作用，使處理效果偏低. 因此，EM菌不適用于與SRB聯(lián)合.

圖2 1∶1接種EM菌和SRB菌對(duì)鉛浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of 1∶1 EM and SRB inoculation on lead leaching state

2.3 單一固定劑對(duì)土壤鉛的固定效果

圖3是在相同濃度梯度下，3種固定劑對(duì)土壤中鉛的固定曲線. 由圖3可知，3種固定劑對(duì)土壤鉛的固定效果依次為：沸石>有機(jī)改良膨潤(rùn)土>硅藻土. 沸石最高固定效率達(dá)到61.1%，有機(jī)改良膨潤(rùn)土最高固定效率僅為21.6%，而硅藻土對(duì)鉛的浸出含量并無(wú)明顯影響，表明硅藻土對(duì)鉛不具有明顯的固定作用. 此外，當(dāng)沸石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 mg/g時(shí)，其固定效率大幅提升，由質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 mg/g時(shí)的31.2%升至60.3%；而當(dāng)沸石質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16 mg/g時(shí)，固定效率僅增加了0.8%，因此本研究以8 mg/g作為沸石的最佳添加量，且選擇沸石作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象. 此研究結(jié)果與康宏宇等[19]一致，其原因在于，沸石是一種堿性金屬或堿土金屬的水化鋁硅酸鹽晶體，具有很強(qiáng)的離子交換吸附和專性吸附能力. 主要是通過(guò)調(diào)節(jié)土壤pH值和陽(yáng)離子交換量來(lái)降低鉛的活性[20]，其中沸石對(duì)鉛離子的交換能力最強(qiáng).因此，沸石對(duì)Pb2+有很好的吸附作用[21]. OLIVEIRA等[22]認(rèn)為沸石還可能對(duì)Pb2+有很好的催化去除效果，其催化的許多反應(yīng)屬于正碳離子型.

圖3 不同固定劑對(duì)土壤鉛離子的固定效率Fig.3 The fixed efficiencies of different fixatives on soil lead

2.4 微生物與固定劑組配對(duì)土壤鉛的固定效果

在SRB接種量為4 mL、沸石質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 mg/g 時(shí)， 將最佳單一固定劑沸石與具有固定效果的SRB進(jìn)行組配，探究其對(duì)土壤中鉛的修復(fù)效果. 圖4表示單一SRB、單一固定劑沸石和SRB+沸石3種處理方式對(duì)鉛的固定效率. 結(jié)果表明，SRB+沸石聯(lián)合修復(fù)體系的固定效率最高，達(dá)到70.14%，而單一沸石處理的固定效率為60.3%，單一SRB處理的固定效率僅為38.2%. SRB+沸石聯(lián)合修復(fù)體系固定效率比相同條件下單一沸石處理提高了一倍，比單一SRB處理提高了近10%. 究其原因，沸石主要通過(guò)改變土壤pH值來(lái)抑制土壤中鉛的活性[23].李華等[20]研究發(fā)現(xiàn)沸石可以使土壤pH值升高，土壤的氧化還原電位會(huì)顯著降低，可能使厭氧微生物SRB活性增加[24]，進(jìn)一步提高了固定效率. 由此可見(jiàn)，pH值是影響SRB+沸石聯(lián)合修復(fù)體系固鉛穩(wěn)定性的重要因素，不僅可能改變Pb2+的存在形態(tài)，增加溶出量，還會(huì)影響SRB的活性. 不過(guò)微生物能否降低對(duì)鈍化后土壤原生態(tài)系統(tǒng)的影響，還有待于進(jìn)一步探究.

圖4 不同處理方式對(duì)鉛的固定效率Fig.4 Fixed efficiencies of different treatments for lead

3 結(jié) 論

1)SRB對(duì)土壤鉛具有固定作用，隨接種菌液量的增加，土壤鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷降低. 當(dāng)接種SRB液體積為4 mL時(shí)，鉛的浸出態(tài)質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少38.32%. EM菌則對(duì)土壤中鉛起到了活化作用.

2)單一固定劑對(duì)土壤鉛的固定效果依次為：沸石>有機(jī)改良膨潤(rùn)土>硅藻土. 沸石對(duì)土壤鉛的固定效率最高，其固定效率可達(dá)到61.1%，有機(jī)改良膨潤(rùn)土的最高固定效率為21.6%，而硅藻土對(duì)土壤鉛沒(méi)有明顯的固定效果.

3)SRB+沸石處理鉛污染土壤效果最佳，其中SRB接種量為4 mL、沸石添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 mg/g 時(shí)，固定效率達(dá)到70.14%. 固定效率比相同條件下單一沸石處理提高了1倍，比單一SRB處理提高了近10%.