司仙科 李煒 于昆 張計(jì)訓(xùn) 曹亦軍 楊佳華

摘 要 目的：構(gòu)建針對人幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1（chitinase-3-like protein-1， CHI3L1）基因的短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA， shRNA）干擾表達(dá)載體，觀察CHI3L1基因表達(dá)對人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法：根據(jù)人CHI3L1基因序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建CHI3L1基因的shRNA真核表達(dá)載體，通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)和Western-Blot方法檢測BGC-823細(xì)胞的CHl3L1 mRNA和CHl3L1基因的表達(dá)，通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察BGC-823細(xì)胞的增殖情況，通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察BGC-823細(xì)胞侵襲能力的變化。結(jié)果：建立了穩(wěn)定表達(dá)CHI3L1 shRNA的BGC-823細(xì)胞的CHI3L1 mRNA和CHI3L1基因的表達(dá)均顯著減少，且見CHI3L1 shRNA可顯著抑制BGC-823細(xì)胞的增殖和侵襲能力。結(jié)論：干擾CHI3L1基因的表達(dá)可顯著抑制BGC-823細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

關(guān)鍵詞 胃癌 人幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1 增殖 侵襲

中圖分類號：R735.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）21-0062-04

Expression of human chitinase-3-like protein-1 in gastric cancer and its effect on proliferation and invasion of gastric cancer cells*

SI Xianke**， LI Wei， YU Kun， ZHANG Jixun， CAO Yijun， YANG Jiahua***（Department of General Surgery， Putuo Hospital， Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200062， China）

ABSTRACT Objective： To construct a short hairpin RNA （shRNA） interference expression vector containing a gene encoding human chitinase-3-like protein-1 （CHI3L1） and observe the effect of CHI3L1 gene expression on the proliferation and invasion of human gastric cancer cell line BGC-823. Methods： The shRNA eukaryotic expression vector containing a gene encoding human CHI3L1 was designed and constructed based on CHI3L1 gene sequence and the transfection effect was observed by fluorescence microscopy. CHl3L1 mRNA and its gene expression in BGC-823 cells were detected by reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Western-Blot. The proliferation and the invasion ability of BGC-823 cells were observed by clonogenic assay and Transwell method. Results： CHI3L1 mRNA and CHI3L1 expression in BGC-823 cells were significantly reduced and the proliferation and the invasion ability of BGC-823 cells were significantly inhibited by CHI3L1 shRNA. Conclusion： The expression of interference CHI3L1 can significantly inhibit the proliferation and invasion of gastric cancer cell.

KEy WORDS gastric cancer； human chitinase-3-like protein-1； proliferation； invasion

目前認(rèn)為，胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移是一個(gè)連續(xù)、復(fù)雜的主動(dòng)過程，與多種相關(guān)基因和分子標(biāo)志物有關(guān)[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，人幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1（chitinase-3-like protein-1， CHI3L1）在多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[2-3]。但對人CHI3L1在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及其可能的意義卻迄今尚無系統(tǒng)性的研究。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建靶向干擾人CHl3L1的重組慢病毒表達(dá)載體，觀察其對人胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞和人胚腎上皮細(xì)胞株HEK 293T細(xì)胞（均由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院提供）。

1.1.2 主要試劑與儀器

BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和蛋白電泳制膠所需試劑（均為上海秀材生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品）；RP-MI1640培養(yǎng)基、胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基（均為美國GIBCO公司產(chǎn)品）；慢病毒轉(zhuǎn)移載體pGMLV、重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pAX2（均為德國Qiagen公司產(chǎn)品）；聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction， PCR）試劑盒（日本Takara公司產(chǎn)品）。

熒光定量PCR儀、熒光顯微鏡和自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀（均由上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒干擾載體的構(gòu)建

針對目的基因CHI3L1基因，應(yīng)用公用網(wǎng)站中提供的RNA干擾序列（XM 005244857.1 PREDICTED： Homo sapiens chitinase-3-like l， mRNA）設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)序列，然后根據(jù)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行測定、評估，選擇具有最佳動(dòng)力學(xué)參數(shù)的干擾靶點(diǎn)序列進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)流程。根據(jù)CHI3L1基因分別設(shè)計(jì)并合成3對短發(fā)卡RNA（short hairpin RNA， shRNA）寡聚單鏈DNA，退火成雙鏈RNA，再將此3對雙鏈RNA的shRNA寡聚單鏈DNA序列的5 to 3序列分別插入至shRNA慢病毒載體中，構(gòu)建出3個(gè)shRNA慢病毒重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，最后成功構(gòu)建成pGMLV-SC1 RNAi慢病毒載體。

1.2.2 慢病毒的包裝

胰酶消化對數(shù)生長期的HEK 293T細(xì)胞，然后將其接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60% ～ 70%時(shí)，加入質(zhì)粒和磷酸鈣的混合液，混勻后培養(yǎng)6 ～ 8 h。棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液，清洗后再加入6 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。收集轉(zhuǎn)染72 h后的 HEK 293T細(xì)胞上清液，于4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，然后以0.45 μm濾器過濾。超速離心（25 000 r/min）2 h，以冰磷酸鹽緩沖液重旋病毒沉淀，4 ℃下溶解過夜。

1.2.3 病毒滴度的測定

病毒滴度測定的前1天，對HEK 293T細(xì)胞進(jìn)行傳代，96孔培養(yǎng)板上每個(gè)孔中加入100 μl的病毒原液（約5×104個(gè)細(xì)胞/ml），第2天確認(rèn)細(xì)胞狀態(tài)沒有問題。準(zhǔn)備3 ～ 5個(gè)無菌EP管，每管中加入90 μl DMEM完全培養(yǎng)基和10 μl待測病毒原液，輕輕混勻。吸去90 μl培養(yǎng)基，然后將稀釋好的病毒液從低濃度到高濃度依次加至培養(yǎng)板的孔中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后再在每孔中加入100 μl的新鮮培養(yǎng)基，小心操作，不要吹起細(xì)胞。72 h后，通過熒光顯微鏡計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞，并結(jié)合稀釋倍數(shù)計(jì)算病毒滴度。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將BGC-823細(xì)胞加至含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照操作說明書進(jìn)行shRNA真核表達(dá)載體（shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3）和shRNA空白載體的轉(zhuǎn)染。對處于對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化，制成細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液（約含5×104個(gè)細(xì)胞）接種于6孔培養(yǎng)板上，于37 ℃、5% CO2恒溫箱中孵育24 h。將慢病毒和磷酸鈣的混合液按感染指數(shù)10∶1轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中并混勻，培養(yǎng)6 ～ 8 h后棄去含有轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)液。以磷酸鹽緩沖液沖洗3次，再在6孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入1 ml RP-MI1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2恒溫箱中孵育48 h。應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.5 Western-Blot實(shí)驗(yàn)

制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠。電泳分離CHI3L1蛋白后轉(zhuǎn)膜，將膜取出，轉(zhuǎn)移至塑料自封袋中，加入10 ml封閉液靜置1 h。倒出封閉液，加入4 ml一抗溶液，于4 ℃下水平搖床上孵育過夜。室溫下，將膜在磷酸鹽緩沖液中浸洗3次，15 min/次。同一抗操作，取出膜，轉(zhuǎn)移至塑料自封袋中，加入4 ml二抗溶液，室溫下孵育1 h，然后再將膜在磷酸鹽緩沖液中浸洗3次，15 min/次。將混合后的檢測試劑均勻加至雜交膜上，反應(yīng)3 ～ 5 min。用薄膜覆蓋雜交膜，趕出多余發(fā)光液，在暗房中壓片、顯影。

1.2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

將構(gòu)建好的穩(wěn)轉(zhuǎn)系細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化、計(jì)數(shù)，然后接種于6孔培養(yǎng)板上，每孔接種100個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，期間觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。應(yīng)用4%多聚甲醛固定法室溫固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，掃描拍照。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

向Transwell小室的上孔均勻加入已預(yù)作饑餓處理的細(xì)胞懸液，每孔中約5×104個(gè)細(xì)胞，再在上層加無血清培養(yǎng)基，下層加含血清的培養(yǎng)基，8 ～ 24 h后觀察細(xì)胞的穿透情況。應(yīng)用4%多聚甲醛固定法室溫固定30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。用水沖洗掉結(jié)晶紫后，將上層細(xì)胞擦掉。隨機(jī)選擇5個(gè)視野，于顯微鏡下觀察上層細(xì)胞下底面的細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 CHI3L1的慢病毒包裝及穩(wěn)轉(zhuǎn)系的構(gòu)建

從圖1可知，已在BGC-823細(xì)胞中成功構(gòu)建了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3穩(wěn)轉(zhuǎn)系。

2.2 Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測BGC-823細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)系中CHI3L1的表達(dá)水平

從圖2可知，在已構(gòu)建了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3穩(wěn)轉(zhuǎn)系的BGC-823細(xì)胞中，CHI3L1的表達(dá)均顯著減少。

2.3 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測CHI3L1 shRNA對BGC-823細(xì)胞增殖的影響

從圖3可知，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1的shRNA-1、shRNA-2和shRNA-3的BGC-823細(xì)胞的克隆數(shù)顯著減少，說明CHI3L1 shRNA-1、CHI3L1 shRNA-2和CHI3L1 shRNA-3均能顯著抑制BGC-823細(xì)胞的增殖。

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測CHI3L1 shRNA對BGC-823細(xì)胞侵襲能力的影響

從圖4可知，CHI3L1 shRNA-1、CHI3L1 shRNA-2和CHI3L1 shRNA-3均能顯著抑制BGC-823細(xì)胞的侵襲能力。

3 討論

CHI3L1基因位于1號染色體q32，由分布于8 kb區(qū)域上的10個(gè)外顯子構(gòu)成，含383個(gè)氨基酸。CHI3L1是結(jié)締組織細(xì)胞的生長因子，同時(shí)也是內(nèi)皮細(xì)胞之間形成黏附和發(fā)生遷移的重要因素[4]。CHI3L1與多種疾病相關(guān)，包括哮喘[5]、冠心病[6]、炎癥性腸病[7]、精神分裂癥和2型糖尿病等。近年研究還發(fā)現(xiàn)，CHI3L1水平升高與多種腫瘤的增殖、分化、浸潤、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8-11]。例如，Junker等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在小細(xì)胞肺癌中，CHI3L1的表達(dá)與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；Pelloski等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在膠質(zhì)瘤中，CHI3L1的表達(dá)可引起腫瘤增殖，且與腫瘤對放療的不敏感性相關(guān)，致使預(yù)后不佳；付亮等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1在膽囊癌中高表達(dá)，其表達(dá)水平與膽囊癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。

RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術(shù)是一種采用雙鏈RNA誘發(fā)mRNA水平上的基因沉默、進(jìn)而抑制蛋白產(chǎn)物表達(dá)的技術(shù)。Libreros等[15]應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制乳腺癌細(xì)胞中CHI3L1的表達(dá)，引起趨化因子配體-2、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9等分泌減少，導(dǎo)致腫瘤增殖和侵襲能力減弱。Ku等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用RNAi技術(shù)使CHI3L1基因沉默、抑制CHI3L1的表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)選用慢病毒構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體使人胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞的CHI3L1基因沉默，轉(zhuǎn)染成功后，通過PCR和Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，BGC-823細(xì)胞中的CHI3L1 mRNA水平和CHI3L1表達(dá)均受到抑制。此外，通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察到，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1 shRNA的BGC-823細(xì)胞的增殖速率也顯著降低；通過Transwell實(shí)驗(yàn)觀察到，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1 shRNA的BGC-823細(xì)胞的侵襲能力亦顯著減弱，其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了CHI3L1 shRNA-2的BGC-823細(xì)胞的侵襲能力最弱。

Kawada等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CHI3L1是主要通過激活胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases， ERK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase， JNK）信號通路而產(chǎn)生誘導(dǎo)白介素-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1， MCP-1）分泌的。因此，我們猜測，CHI3L1在胃癌細(xì)胞中可能也是主要通過激活ERK和JNK信號通路而促進(jìn)白介素-8和MCP-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移的。當(dāng)然，確切的分子機(jī)制尚待我們未來實(shí)驗(yàn)的深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Ushijima T， Sasako M. Focus on gastric cancer [J]. Cancer Cell， 2004， 5（2）： 121-125.

[2] Johansen JS， Schultz NA， Jensen BV. Plasma YKL-40： a potential new cancer biomarker？ [J]. Future Oncol， 2009， 5（7）： 1065-1082.

[3] Johansen JS， Jensen BV， Roslind A， et al. Serum YKL-40， a new prognostic biomarker in cancer patients？ [J] Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2006， 15（2）： 194-202.

[4] Nishikawa KC， Millis AJ. gp38k （CHI3L1） is a novel adhesion and migration factor for vascular cells [J]. Exp Cell Res， 2003， 287（1）： 79-87.

[5] Ober C， Tan Z， Sun Y， et al. Effect of variation in CHI3L1 on serum YKL-40 level， risk of asthma， and lung function [J]. N Engl J Med， 2008， 358（16）： 1682-1691.

[6] Kucur M， Isman FK， Karadag B， et al. Serum YKL-40 levels in patients with coronary artery disease [J]. Coron Artery Dis， 2007， 18（5）： 391-396.

[7] Vind I， Johansen JS， Price PA， et al. Serum YKL-40， a potential new marker of disease activity in patients with inflammatory bowel disease [J]. Scand J Gastroenterol， 2003， 38（6）： 599-605.

[8] Choi IK， Kim YH， Kim JS， et al. High serum YKL-40 is a poor prognostic marker in patients with advanced non-small cell lung cancer [J]. Acta Oncol， 2010， 49（6）： 861-864.

[9] Steponaitis G， Skiriut？ D， Kazlauskas A， et al. High CHI3L1 expression is associated with glioma patient survival [J/ OL]. Diagn Pathol， 2016， 11： 42 [2018-03-27]. doi： 10.1186/ s13000-016-0492-4.

[10] Vom Dorp F， Tschirdewahn S， Niedworok C， et al. Circulating and tissue expression levels of YKL-40 in renal cell cancer[J]. J Urol， 2016， 195（4 Pt 1）： 1120-1125.

[11] Chiang YC， Lin HW， Chang CF， et al. Overexpression of CHI3L1 is associated with chemoresistance and poor outcome of epithelial ovarian carcinoma [J/OL]. Oncotarget， 2015， 6（37）： 39740-39755 [2018-03-27]. doi： 10.18632/ oncotarget.5469.

[12] Junker N， Johansen JS， Andersen CB， et al. Expression of YKL-40 by peritumoral macrophages in human small cell lung cancer [J]. Lung Cancer， 2005， 48（2）： 223-231.

[13] Pelloski CE， Mahajan A， Maor M， et al. YKL-40 expression is associated with poorer response to radiation and shorter overall survival in glioblastoma [J]. Clin Cancer Res， 2005， 11（9）： 3326-3334.

[14] 付亮， 鎖濤， 張鈺， 等. 幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1在膽囊癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志， 2014， 31（5）： 1114-1116.

[15] Libreros S， Garcia-Areas R， Shibata Y， et al. Induction of proinflammatory mediators by CHI3L1 is reduced by chitin treatment： decreased tumor metastasis in a breast cancer model [J]. Int J Cancer， 2012， 131（2）： 377-386.

[16] Ku BM， Lee YK， Ryu J， et al. CHI3L1 （YKL-40） is expressed in human gliomas and regulates the invasion， growth and survival of glioma cells [J]. Int J Cancer， 2011， 128（6）： 1316-1326.

[17] Kawada M， Seno H， Kanda K， et al. Chitinase 3-like 1 promotes macrophage recruitment and angiogenesis in colorectal cancer [J]. Oncogene， 2012， 31（26）： 3111-3123.