王 可，曹倩玉，趙靈芝，陳龍星，張夢妍

(石家莊市疾病預(yù)防控制中心 理化檢驗(yàn)所，河北 石家莊 050011)

苯氧羧酸類除草劑是世界第二大選擇性除草劑，亦為世界第一大殺除闊葉雜草的除草劑[1]，廣泛應(yīng)用于小麥、玉米、水稻等禾本科作物，可有效防除水、旱田中闊葉和莎草科雜草[2]。此類除草劑易溶于水，自然降解速度較慢，極易在土壤、水環(huán)境及果實(shí)中殘留[3]，其代謝產(chǎn)物(尤其是一些鹵化物)可引起人類肝腎損傷和遲發(fā)性神經(jīng)病變[4]。因此，苯氧羧酸類除草劑在環(huán)境和食品中的殘留受到越來越多的關(guān)注。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中苯氧羧酸類除草劑的最大污染物水平(MCL)為0.05～0.07 mg/L[5]；歐盟規(guī)定谷物中苯氧羧酸類除草劑的殘留限量為0.01～7 mg/kg[6]；我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)《GB 2763-2016》規(guī)定不同食品中2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、二甲四氯和麥草畏的殘留限量分別為0.01～2 mg/kg、0.05～0.1 mg/kg和0.5 mg/kg[7]。

目前，苯氧羧酸類除草劑的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[8]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)[9]、液相色譜法(LC)[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11]和毛細(xì)管電泳法(CE)[12]等。其中，LC-MS/MS法因具有靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確、可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中多種物質(zhì)痕量測定等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留檢測方面應(yīng)用廣泛。國內(nèi)外文獻(xiàn)對于此類除草劑的檢測對象多為土壤、水體與禾谷類農(nóng)作物，且主要集中于1種或幾種除草劑[13-15]，而關(guān)于嬰幼兒谷物食品(米粉和餅干)中多種苯氧羧酸類除草劑殘留的檢測未見報(bào)道。本文采用優(yōu)化的QuEChERS方法對樣品進(jìn)行快速處理，以電噴霧負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時(shí)測定嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑殘留的檢測方法。該方法操作簡便、分析時(shí)間短，精密度高、準(zhǔn)確度好，可推廣應(yīng)用于大批量嬰幼兒谷物食品中苯氧羧酸類除草劑殘留的定性定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Exion-TRIPLE QUAD 5500型高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司)；T660/H型超聲清洗器(德國Elma公司)；C3Ⅰ型臺式離心機(jī)(法國Jouan公司)；MS3型渦旋振蕩器(德國 IKA公司)；Milli-Q型超純水機(jī)(美國Millipore公司)。

苯氧乙酸(Phenoxyacetic acid)、麥草畏(Dicamba)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、2-甲基-4-氯苯氧乙酸(MCPA)、2，4，5-三氯苯氧乙酸(2，4，5-T)、2，4-二氯苯氧丙酸(2，4-DP)、2-甲基-4-氯苯氧丙酸(MCPP)、游離炔草酸(Clodinafop free acid) 、2，4-二氯苯氧丁酸(2，4-DB)、2-甲基-4-氯苯氧丁酸(MCPB)、2，4，5-三氯苯氧丙酸(2，4，5-TP)純度均大于98.5%，購于Dr.Ehrenstorfer公司；甲酸(美國Dikma公司)、甲醇(美國Fisher公司)、乙腈(美國Merck公司)均為色譜純；N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(美國Dikma公司)；C18(40～50 μm，美國Welch公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂(天津永大化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量苯氧羧酸類除草劑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-20 ℃冰箱中。取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈定容，得到1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用乙腈逐級稀釋，配成適當(dāng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL離心管中，加入2 mL水浸潤，再加入4 mL含2%甲酸的乙腈溶液，渦旋30 s，超聲10 min，加入0.5 g NaCl，渦旋混勻后以4 000 r/min離心8 min，移取2 mL有機(jī)相溶液至盛有0.1 g PSA和0.3 g無水MgSO4的15 mL離心管中，渦旋30 s，以8 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液，過0.2 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.4 分析條件

1.4.1色譜條件ZORBAX Eclipse XDB- C18色譜柱(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：4 μL。流動相：A為0.01%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.5 min，50% B；0.5～0.6 min，50%～55% B；0.6～2.9 min，55% B；2.9～3.0 min，55%～95% B；3.0～4.5 min，95% B；4.5～4.6 min，95%～50% B；4.6～8.0 min，50% B。

1.4.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源電壓：-4 500 V；源溫度:550 ℃；氣簾氣(N2)壓力：275.8 kPa；霧化氣(N2)壓力：379.2 kPa；輔助加熱氣(N2)壓力：413.7 kPa；11種苯氧羧酸類除草劑的母離子、碎片離子、去簇電壓(DP)和碰撞能量(CE)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用針泵連續(xù)進(jìn)樣，首先進(jìn)行母離子掃描(Q1 MS)，獲取目標(biāo)物的母離子，然后通過子離子掃描(Product ion)獲取其碎片離子，將母離子和2個(gè)響應(yīng)信號較強(qiáng)的碎片離子組成檢測離子對,以MRM掃描方式優(yōu)化DP和CE。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，11種苯氧羧酸類除草劑易失去H+，形成[M-H]-，其中2，4-D、2，4-DB、2，4，5-T、苯氧乙酸、2，4-DP、MCPP、2，4，5-TP和游離炔草酸均能得到兩個(gè)豐度較高的碎片離子。而MCPA、MCPB和麥草畏僅有1個(gè)碎片([M-RCOOH]-) 的響應(yīng)值較高，由于這3種物質(zhì)的苯環(huán)上均含有氯原子，其同位素[M+2-H]-峰及碎片([M+2-RCOOH]-)的響應(yīng)值較好。因此，對于此3種化合物，選取其同位素母離子和產(chǎn)生的較強(qiáng)的二級碎片離子作為另一個(gè)監(jiān)測離子對，具體參數(shù)見表1。

表1 11種苯氧羧酸類除草劑的色譜保留時(shí)間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Retention times and mass spectrometric parameters of 11 phenoxy acid herbicides

*quantitative ion

圖1 11種苯氧羧酸類除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(50 μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 11 phenoxy acid herbicides mixed standard solution (50 μg/L)the peak number was the same as that in Table 1

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了有機(jī)相為甲醇和乙腈，水相為純水及添加不同含量甲酸(0.001%、0.01%、0.1%)的分離效果、峰形及響應(yīng)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，以乙腈為有機(jī)相時(shí)，各化合物均有較強(qiáng)的響應(yīng)，分離度較好。以純水為水相時(shí)，11種目標(biāo)物的響應(yīng)信號較強(qiáng)，但峰形較差，拖尾嚴(yán)重且出現(xiàn)分裂峰，加入甲酸后雖改善了峰形但響應(yīng)受抑制，且甲酸含量越高，抑制作用越大，尤其對MCPB、2，4-DB和苯氧乙酸最為明顯。因此，綜合考慮各種因素，最終選擇0.01%甲酸水溶液-乙腈為流動相，采用梯度洗脫程序進(jìn)行分離，8 min內(nèi)可以完成11種除草劑的分析(圖1)。

2.3 前處理方法的優(yōu)化

QuEChERS作為一種新型的樣品提取凈化方法，由于具有快速(Quick)、簡單(Easy)、廉價(jià)(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)和安全(Safe)的特點(diǎn)，近年來受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注與應(yīng)用[16]。該方法常以乙腈為提取劑，NaCl為鹽析劑，并在提取液中加入吸附劑與脫水劑(無水MgSO4)以去除樣品中的雜質(zhì)和水分。常見的吸附劑有PSA(去除基質(zhì)中的脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物等雜質(zhì))、C18(去除脂肪性和非極性物質(zhì))和GCB(去除樣品中的色素和甾醇)[17-18]。

苯氧羧酸類除草劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)中均含有羧基官能團(tuán)，屬于酸性農(nóng)藥。因此，本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)QuEChERS方法的基礎(chǔ)上以酸化乙腈為提取劑，考察了甲酸含量分別為0.1%、1%、2%、3%時(shí)的提取效率。結(jié)果表明，2，4-D、MCPA、2，4，5-T和苯氧乙酸受酸度影響較大，提取率隨酸度升高而增強(qiáng)，但酸度超過2%時(shí)回收率變化不大；其他7種除草劑在甲酸含量為2%和3%時(shí)，回收率均在60%以上且差異不大。綜上，最終選擇含2%甲酸的乙腈作為提取劑。同時(shí)對吸附劑進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)GCB對2，4，5-T 、2，4-D 和2，4，5-TP 有較強(qiáng)的吸附作用，C18對苯氧乙酸和麥草畏有較強(qiáng)的吸附作用，而以PSA凈化時(shí)目標(biāo)物的回收率均大于75%，凈化效果較好。對吸附劑用量進(jìn)行了優(yōu)化，最終選用0.1 g PSA和0.3 g無水MgSO4進(jìn)行凈化。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(ME)是指樣品中目標(biāo)分析物以外的其他成分對待測物測定值的影響，使用ESI模式檢測時(shí)，基質(zhì)主要影響目標(biāo)化合物的離子化，使其響應(yīng)信號增強(qiáng)或減弱，從而形成基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)[19]。實(shí)驗(yàn)采用同一濃度待測物在基質(zhì)溶液與溶劑中響應(yīng)值的比值評價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，比值為80%～120%時(shí)，表明基質(zhì)效應(yīng)較小，可忽略；比值低于80%或高于120%時(shí)，表明有較強(qiáng)的基質(zhì)抑制或增強(qiáng)作用，需用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正。將不含目標(biāo)物的樣品按“1.3”方法進(jìn)行提取和凈化得到基質(zhì)溶液，分別比較了質(zhì)量濃度為10、20、50、100 μg/L時(shí)米粉和餅干的基質(zhì)效應(yīng)，得到ME為85.2%～104.3%，表明無明顯的基質(zhì)效應(yīng)，可直接用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1線性關(guān)系、檢出限與定量下限用乙腈逐級稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成0.5～200 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件測定，以各化合物的質(zhì)量濃度(x，μg/ L)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)定量離子對的峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算得到各化合物的檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)。如表2所示，11種苯氧羧酸類除草劑在0.5～200 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.999；方法的LOD為0.1～2.4 μg/kg，LOQ為0.4～8.1 μg/kg。

表2 11種苯氧羧酸類除草劑的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 2 Linear relationships，LODs and LOQs of 11 phenoxy acid herbicides

2.5.2回收率與精密度對米粉和餅干樣品分別進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)水平平行測定7次，得到11種苯氧羧酸類除草劑的平均回收率為77.4%～99.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～8.0%(表3)。表明本方法的準(zhǔn)確度高，精密度好，可滿足嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑的檢測要求。

2.6 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法對市售22份嬰幼兒谷物食品(14份米粉和8份餅干)進(jìn)行11種苯氧羧酸類除草劑的同時(shí)檢測，其中2份餅干樣品檢出麥草畏，含量分別為8.08、18.42 μg/kg，低于《GB 2763-2016》中谷物類食品的最大殘留限量要求(500 μg/kg)[7]；2份餅干樣品分別檢出2，4-DP(3.05 μg/kg)和MCPP(3.24 μg/kg)；2份米粉樣品分別檢出 MCPB(2.42 μg/kg)和2，4，5-TP(4.50 μg/kg)。目前，我國國家標(biāo)準(zhǔn)中未有針對嬰幼兒谷物食品中苯氧羧酸類除草劑的限量標(biāo)準(zhǔn)，《GB 2763-2016》中的谷物類食品農(nóng)藥最大殘留限量也未涉及2，4-DP、MCPP、MCPB和2，4，5-TP。

表3 11種苯氧羧酸類除草劑的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=7)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 11 phenoxy acid herbicides(n=7)

3 結(jié) 論

本文采用HPLC-MS/MS建立了同時(shí)測定嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑的檢測方法。實(shí)驗(yàn)對提取劑、吸附劑、色譜-質(zhì)譜條件分別進(jìn)行了優(yōu)化，并考察了基質(zhì)效應(yīng)的影響。結(jié)果表明，該方法能有效避免基質(zhì)干擾，前處理操作簡便、分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、靈敏度好，適用于大批量嬰幼兒谷物食品中11種苯氧羧酸類除草劑的定性定量分析。