張 艷，吳銀良

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040)

頭孢菌素類藥物(Cephalosporins，CEPs)又名先鋒霉素類藥物，屬β-內(nèi)酰胺抗生素，獸醫(yī)臨床應(yīng)用廣泛。CEPs品種多，現(xiàn)已發(fā)展到第五代。頭孢菌素類藥物雖較青霉素類藥物過敏反應(yīng)低，但過量使用會導(dǎo)致人體內(nèi)白血球降低，影響內(nèi)臟功能，發(fā)生臟器損傷等，對老人、兒童，特別是胎兒的影響較大[1-2]。為保障公眾健康安全，我國已對頭孢氨芐、頭孢喹肟和頭孢噻呋3種頭孢菌素類藥物制定了動物性食品中最高殘留限量(Maximum residue limit,MRL)(20～200 μg/kg)[3]；但對于常用的頭孢拉定、頭孢噻肟等藥物，目前尚未制定其MRL，因此在畜禽生產(chǎn)中存在濫用頭孢菌素類藥物的現(xiàn)象?？紤]到抗生素的耐藥性問題，部分國家目前已禁止在家畜飼料中使用頭孢菌素類藥物[4]。因此，為保障人類用藥和我國動物性食品安全，建立簡單、快速的測定飼料中頭孢菌素類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法具有重要意義。

目前頭孢菌素類藥物的檢測方法常使用微生物法[5]、液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-16]和毛細(xì)管電泳法[17]，且主要集中于牛奶[10-11,15]和肉[9,14,17]類樣品，少數(shù)方法涉及雞蛋[16]和飼料樣品[12-13]。國內(nèi)尚無有關(guān)飼料中頭孢菌素類藥物分析方法的研究。固相萃取小柱凈化是最常用的前處理手段[8,10,15]，考慮到頭孢菌素類藥物在中性和酸性條件下固相萃取保留較差，通常在上柱前將溶液調(diào)至pH 8.5左右[15]，從而導(dǎo)致已有方法工序復(fù)雜、操作繁瑣、成本較高，難以滿足批量樣品同時(shí)分析的需要。本研究比較了提取液直接稀釋與固相萃取凈化方法的性能參數(shù)，建立了提取后直接稀釋進(jìn)樣分析配合飼料中頭孢菌素類藥物的LC-MS/MS方法。該方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確、靈敏的優(yōu)點(diǎn)，為飼料中頭孢菌素類藥物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC XevoTMTQ-S micro超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，配置電噴霧離子源； IKA Vortex Genie 3漩渦振蕩器(德國IKA公司)，低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司)。

頭孢菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：頭孢氨芐、頭孢拉定、頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢喹肟、頭孢噻肟、頭孢噻呋、頭孢羥氨芐、頭孢呋辛(德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH)，頭孢乙腈、頭孢匹林(德國WITEGA laboratorien Berlin-Adlershof GmbH)，頭孢洛寧、頭孢噻吩、頭孢他定(加拿大Toronto Research Chemicals公司)，頭孢克洛、頭孢丙烯(中國食品藥品檢定研究院)，所有標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于92%。甲醇、乙腈(色譜純，德國Merck公司)，甲酸(色譜純，美國Tedia公司)，HLB小柱(500 mg/6 mL，美國Waters公司)；實(shí)驗(yàn)用水為 Milli-Q 超純水。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Acquity BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為甲醇；梯度洗脫條件：0～1.0 min，5%B；1.0～4.5 min，5%～50%B；4.5～7.5 min，50%～70%B；7.5～7.6 min，70%～5%B，7.6～9.0，5%B；流速0.30 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

ESI源正離子模式電離；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：2.5 kV；萃取錐孔電壓：25 V；RF透鏡電壓：0.5 V；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；錐孔氣流速：30 L/h；脫溶劑氣流速：1 000 L/h；其它條件見表1。

表1 16種頭孢菌素類藥物的保留時(shí)間、母離子、子離子、錐孔電壓及碰撞能量Table 1 Retention times,precursor ions，product ions，cone voltages and collision energies of 16 cephalosporins

(續(xù)表1)

No.CompoundRetention time(min)Precursor ion(m/z)Product ions(m/z)Cone voltage(V)Collision energy(eV)13Cefuroxime(頭孢呋辛)5.57447.0341.9*,385.91612,1014Ceftazidime(頭孢他定)4.48547.0166.7,467.9*426,1015Cefaclor(頭孢克洛)5.15367.9105.7*,173.8618,1416Cefprozil(頭孢丙烯)4.95390.0113.6*,207.8618,8

*quantitation ion

1.3 樣品前處理

取試樣5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL聚丙烯離心管中，加入乙腈-水(40∶60)溶液25 mL，以300 r/min振蕩提取30 min，再以5 000 r/min離心5 min后，用乙腈-水(40∶60)溶液25 mL重復(fù)提取1次，合并上清液至50 mL容量瓶中，用乙腈-水(40∶60,體積比)溶液定容。吸取0.4 mL上清液，加0.1%甲酸溶液0.6 mL，混合均勻，過0.22 μm濾膜后，待測定。

1.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對陰性豬配合飼料進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，樣品處理同“1.3”，頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢乙腈、頭孢喹肟、頭孢噻吩、頭孢呋辛和頭孢他定7種藥物的加標(biāo)水平為50、500、2 500 μg/kg，其余頭孢菌素類藥物的加標(biāo)水平為10、50、500、2 500 μg/kg。稱樣后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻放置0.5 h后進(jìn)行樣品處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

已建立的頭孢菌素類藥物的LC-MS/MS分析方法通常采用正離子模式進(jìn)行電離[8-16]。本實(shí)驗(yàn)用水-甲醇(95∶5，體積比)溶液分別配制1.0 mg/L的16種頭孢菌素類藥物溶液，利用儀器自帶Intellistart軟件優(yōu)化質(zhì)譜條件并獲得定性、定量離子對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16種頭孢菌素類藥物在正離了模式下均能獲得較好的響應(yīng)，其中頭孢唑林、頭孢乙腈、頭孢噻吩和頭孢呋辛的母離子均為[M+Na]+，其余頭孢菌素類藥物的母離子為[M+H]+；同時(shí)發(fā)現(xiàn)頭孢噻吩和頭孢呋辛在負(fù)離子模式下也有較好的響應(yīng)，但與正離子模式下的分析靈敏度差異不顯著，因此本研究采用表1中的質(zhì)譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

文獻(xiàn)表明，當(dāng)采用Waters超高效液相色譜儀分析頭孢菌素類藥物時(shí)，Waters Acquity UPLC BEH C18、Waters Acquity Xselect CSH C18等色譜柱均能取得較好的保留和分離效果[7]，因此本實(shí)驗(yàn)采用Waters Acquity UPLC BEH C18柱考察了甲酸溶液-甲醇和甲酸溶液-乙腈2種流動相體系的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用0.1%甲酸-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，頭孢乙腈、頭孢唑林等藥物的響應(yīng)較差，而采用0.1%甲酸-甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)16種頭孢菌素類藥物的響應(yīng)均較好，因此確定0.1%甲酸-甲醇體系為流動相，梯度洗脫條件見“1.2”。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

生物樣品中頭孢菌素類藥物的常用提取劑有甲醇[13]、甲醇-水[12]和乙腈-水[8-9,16]等。因飼料樣品中通常富含蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)，用甲醇或甲醇-水提取時(shí)樣液較混濁，需進(jìn)一步凈化去除蛋白。而用乙腈提取時(shí)，因蛋白變性沉淀，提取后雜質(zhì)少，且提取液澄清，因此本研究使用乙腈、乙腈-水(50∶50，體積比)、乙腈-水(40∶60，體積比)和乙腈-水(25∶75，體積比)4種提取液對豬配合飼料在500 μg/kg加標(biāo)水平下進(jìn)行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用乙腈提取時(shí)所有藥物的回收率均在10%以下，采用乙腈-水(50∶50)和乙腈-水(25∶75)提取時(shí)，不能使所有頭孢菌素類藥物的提取回收率達(dá)到90%以上；而采用乙腈-水(40∶60)時(shí)，所有頭孢菌素類藥物的回收率均大于90%，因此確定以乙腈-水(40∶60)進(jìn)行提取。目前用于動物性食品提取的乙腈溶液中乙腈含量均高于60%[7-8,15]，而本實(shí)驗(yàn)中乙腈的比例僅為40%，可能是飼料樣品比動物性食品的含水量低所致。

500 μg/kg的豬配合飼料加標(biāo)樣品經(jīng)乙腈-水(40∶60)提取后，比較了直接稀釋法與固相萃取法的加標(biāo)回收率、方法靈敏度、基質(zhì)效應(yīng)和用時(shí)，其中固相萃取法參考GB/T 22942-2008[18]，即5 mL提取液用25 mL磷酸二氫鈉緩沖溶液稀釋后，調(diào)至pH 8.5過柱，用乙腈洗脫吹干后以15%乙腈溶解(溶解液體積分別為1.0、12.5 mL)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，直接稀釋法的回收率(88.7%～93.6%)明顯高于固相萃取法(75.2%～82.1%)；當(dāng)固相萃取法采用1.0 mL的15%乙腈溶解時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)明顯大于直接稀釋法(圖1)，而采用12.5 mL 15%乙腈溶解時(shí)，基質(zhì)效應(yīng)比直接稀釋法略有改善，斜率比值(基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值)在0.8～1.2范圍外的藥物由4種減至1種(圖1)；直接稀釋法的靈敏度(檢出限為1.5～15 μg/kg)比固相萃取法采用1.0 mL 15%乙腈溶液溶解時(shí)(檢出限為0.12～1.5 μg/kg)的靈敏度低；時(shí)間方面，直接稀釋法完成6個(gè)樣品的稀釋僅需3 min，而固相萃取法則需約2.5 h。動物性食品中MRL限量為20～200 μg/kg，頭孢菌素類藥物在飼料中使用濃度通常較高[3]。綜合考慮用時(shí)、基質(zhì)效應(yīng)和回收率，本實(shí)驗(yàn)最終采用直接稀釋法。

圖1 不同凈化方式下的基質(zhì)效應(yīng)Fig.1 Matrix effects of different purification methods the order number of the cephalosporins is the same as that in Table 1

2.3 線性實(shí)驗(yàn)

在優(yōu)化條件下，利用稀釋后的豬配合飼料空白樣品提取液配制0.1、0.5、5、20、50、200、500 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(其中頭孢唑林、頭孢哌酮、頭孢乙腈、頭孢喹肟、頭孢噻吩、頭孢呋辛和頭孢他定為0.5、5、20、50、200、500 μg/L)進(jìn)行LC-MS/MS分析，以峰面積(Y)對相應(yīng)質(zhì)量濃度(X，μg/L)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。16種頭孢菌素類藥物在上述質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r2均大于0.999。

2.4 方法的專屬性

按照“1.4”方法同時(shí)進(jìn)行空白豬配合飼料樣品、加標(biāo)樣品和干擾樣品(空白樣品中添加β-內(nèi)酰胺類藥物青霉素G、青霉素V、氯唑西林、苯唑西林、氨芐西林、阿莫西林、雙氯西林)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白樣品和干擾樣品未出現(xiàn)干擾峰，表明方法的專屬性較好。

2.5 回收率、精密度與檢出限

按照“1.4”方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每批次同一濃度5個(gè)平行樣品，重復(fù)3次，其中第1批的結(jié)果見表2，加標(biāo)樣品的MRM色譜圖見圖2。由表2可知，16種頭孢菌素類藥物的加標(biāo)回收率為88.4%～93.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%～4.7%，滿足飼料中頭孢菌素類藥物含量的測定要求。按3倍信噪比(S/N=3)計(jì)算該方法對16種頭孢菌素類藥物的檢出限(LOD)為1.5～15 μg/kg；按S/N=10計(jì)算得定量下限(LOQ)為5.0～50 μg/kg。我國農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定頭孢氨芐、頭孢喹肟和頭孢噻呋在動物性食品中的MRL為20～200 μg/kg[3]，而本研究的分析對象為飼料，其分析要求通常低于動物性食品，且本方法檢出限可達(dá)1.5～15 μg/kg，因此能滿足飼料中該類藥物含量的分析需要。

表2 豬配合飼料中16種頭孢菌素類藥物的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

*no recovery experiments have been carried out

2.6 方法應(yīng)用

采用優(yōu)化后的樣品前處理方法和分析條件分別對隨機(jī)采集的16個(gè)配合飼料樣品進(jìn)行分析，均未檢出上述16種頭孢菌素類藥物。

3 結(jié) 論

通過提取方法和儀器條件優(yōu)化，建立了同時(shí)分析配合飼料中16種頭孢菌素類藥物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，樣品經(jīng)乙腈-水溶液提取后可直接稀釋進(jìn)樣分析。16種藥物在10～2 500 μg/kg加標(biāo)范圍內(nèi)的平均回收率為88.4%～93.6%，RSD為0.8%～4.7%；檢出限為1.5～15 μg/kg，定量下限為5.0～50 μg/kg。方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確和靈敏的特點(diǎn)，能滿足飼料中16種藥物含量分析的需要。