程家興，黎明陽，楊雨希，楊 茜，袁 滌，楊 頡，王毅聰，張銳利，杜振霞*

(1.北京化工大學(xué) 理學(xué)院，北京 100029；2.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300)

紅棗是中國新疆產(chǎn)量較大的瓜果之一，具有較高的營養(yǎng)和保健價值。真菌毒素污染是現(xiàn)階段影響紅棗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重大隱患，相關(guān)菌株侵染造成的新疆紅棗“黑斑病”爆發(fā)越來越頻繁，導(dǎo)致近幾年紅棗產(chǎn)量平均損失達30%以上(極端天氣達60%)，和田地區(qū)棗園發(fā)病率更是高達50%以上[1]，造成了巨大經(jīng)濟損失。有研究報道紅棗黑斑病致病菌主要為鏈格孢菌[2]，而鏈格孢菌鏈格孢菌毒素對人體有較大危害[3]，會引發(fā)細胞DNA突變，提高癌癥發(fā)病率[4]。鏈格孢菌較為重要的代謝物有二苯并吡喃酮衍生物——鏈格孢酚(Alternariol，AOH) 、交鏈格孢酚單甲醚(Alternariol monomethyl ether，AME)、細交鏈格孢菌酮酸(Tenuazonic acid，TEA)及騰毒素(Tentoxin，TEN)，而TEN是僅有的一種多肽類代謝產(chǎn)物，且毒性較強[5-6]。鏈格孢菌種可在低溫下生長，在紅棗的生長、采摘、儲運及加工過程中也有產(chǎn)生鏈格孢菌毒素的風(fēng)險。因此，針對新疆紅棗中鏈格孢菌毒素的檢測及風(fēng)險評估具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

Arcella等[7]使用毒理學(xué)關(guān)注閾值(TTC)方法評估了這些毒素對人體健康的影響。2011年，歐洲食品安全局(EFSA)針對飼料和食品中鏈格孢菌產(chǎn)生的毒素導(dǎo)致的公共衛(wèi)生風(fēng)險提出了科學(xué)意見[8]。目前，除巴伐利亞健康和食品安全權(quán)威機構(gòu)外，世界各地均無關(guān)于霉菌毒素的法規(guī)[9]。Wei等[10]對中國干果中的鏈格孢菌毒素與其他毒素進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在31.4%的干果中同時存在2～4種真菌毒素。故對鏈格孢菌的定性定量分析意義重大。目前關(guān)于紅棗中鏈格孢菌毒素的定性定量研究較少，因此亟需建立紅棗中該毒素的快速檢測方法。

目前文獻報道的檢測鏈格孢毒素的方法有液相色譜(LC)法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[11]、薄層色譜(TLC)法[12]、氣相色譜(GC)及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法[13]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法[14]。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)檢測紅棗中鏈格孢菌毒素的方法，借鑒QuEChERS前處理方法，在保證較高回收率的情況下，簡化了前處理的步驟，相比已有方法具有檢出限低、檢測時間短等優(yōu)勢。本方法樣品前處理簡單，回收率高，基質(zhì)效應(yīng)低，提高了TEA、AOH在質(zhì)譜中的靈敏度，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，可滿足大棗中4種鏈格孢菌毒素的檢測要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Quatrro-Premier XE超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司)，配有ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；KH-100DE型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；WH-861渦旋混合器(太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司)；Anke TGL-16G高速離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli-Q A10超純水器(美國Millipore公司)；0.22 μm有機濾膜(津騰公司)。

交鏈格孢酚單甲醚(AME)、鏈格孢酚(AOH)、騰毒素(TEN)、細交鏈格孢菌酮酸(TEA)標準品(純度>98%，新加坡Pribolab公司)。乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Chemical公司)；甲酸(純度>98%，Acros公司)；氯化鈉(分析純，Aladdin公司)。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備液：準確稱取1.00 mg 4種毒素標準樣品溶于1 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液中，配制成質(zhì)量濃度為1.0 g/L標準貯備液，-20 ℃保存。

標準工作液：使用2.0%甲酸-乙腈溶液配制質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100、500、1 000、2 000、5 000 μg/L的TEA、AME、TEN和AOH混合標準溶液。

1.3 樣品前處理

準確稱量0.2 g(精確至0.01 g)紅棗樣品于10 mL離心管中，加入5 mL 2.0%甲酸-乙腈溶液，20 ℃下恒溫超聲提取30 min，加入0.2 g NaCl固體粉末，渦旋30 s后以8 000 r/min離心10 min，用注射器取上清液，過0.22 μm有機濾膜后上機檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

超高效液相色譜條件：流動相：A為超純水,B為乙腈。洗脫梯度：0～3.0 min，95%～60%A;3.0～4.3 min，60%～5%A;4.3～5.0 min，5%A；5.0～5.1 min,5%～95%A;5.1～6.0 min,95%A;流速：0.35 mL/min，色譜柱:Acquity UPLC BEH C18液相色譜柱( 50 mm ×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫：35 ℃，進樣量：2 μL。

質(zhì)譜條件：離子化模式：電噴霧離子源(ESI-)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓2.5 kV,離子源溫度120 ℃，脫溶劑溫度 350 ℃，脫溶劑氣流量 650 L/h，錐孔反吹氣流量 50 L/h，碰撞氣流量 0.15 L/min。4種鏈格孢霉毒素的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 4種鏈格孢霉毒素的串聯(lián)質(zhì)譜測定參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of fouralternaria mycotoxins

*quantitation ion

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜條件的選擇

在ESI-電離模式下，以[M-H]-的準分子離子峰作為母離子，得到TEN、TEA、AOH、AME的母離子分別為m/z413.3、196.1、257.1、271.1。再進行子離子掃描，確定MS/MS中兩個子離子豐度較高時的碰撞電壓，并確定各目標化合物的定性和定量離子對。

實驗發(fā)現(xiàn)在配制標準品溶液時加入甲酸可顯著提高TEA和AOH的質(zhì)譜響應(yīng)。分別比較了使用0.1%甲酸-初始流動相、0.5%甲酸-初始流動相、1.0%甲酸-初始流動相、1.5%甲酸-初始流動相、2.0%甲酸-初始流動相和2.5%甲酸-初始流動相配制毒素標準品時的質(zhì)譜響應(yīng)，結(jié)果表明用2.0%甲酸-初始流動相配制的毒素標準品溶液的響應(yīng)最高。

選用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱進行色譜條件優(yōu)化。考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol乙酸銨水溶液和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液多種流動相的分離效果，結(jié)果表明在流動相中加入甲酸或乙酸銨均會抑制毒素在質(zhì)譜中的響應(yīng)，最終確定以乙腈-水作為流動相，優(yōu)化并確立了梯度洗脫程序。

圖1 4種鏈格孢菌毒素的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of fouralternaria mycotoxins

在優(yōu)化色譜條件下，難分離的AOH和TEN得到更好的分離[15]，TEA和AOH的靈敏度也進一步提高，圖1為4種毒素混合標準溶液的總離子流圖。

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1樣品量的影響文獻[16-17]一般采用2.0～5.0 g樣品進行鏈格孢菌毒素提取，通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，實際被鏈格孢菌感染的紅棗中4種毒素的含量很高，尤其是TEA在樣品量高于0.5 g時即超出線性范圍，易造成色譜柱過載。本實驗分別考察了0.1、0.2、0.5 g樣品量對紅棗鏈格孢菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明，當樣品量為0.1、0.2 g時的回收率相近，4種毒素的回收率均在90%以上，但0.1 g樣品量下部分毒素的精密度和重現(xiàn)性差，AOH和TEA的相對標準偏差(RSD)為10.1%～21.3%。樣品量為0.5 g時，TEA的平均回收率降至75.4%，因此選擇0.2 g為樣品的稱取量。

2.2.2提取溶劑的影響4種毒素極性均較大，因此本實驗分別選用極性較大的有機溶劑(即含2.0%甲酸的甲醇和含2.0%甲酸的乙腈)對紅棗中的鏈格孢菌毒素進行提取。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以含2.0%甲酸的甲醇作為提取溶劑時,溶液顏色變深，表明基質(zhì)效應(yīng)明顯，且4種毒素的回收率均下降，其中TEA的回收率由103%降至62.4%。因此，本實驗選擇2.0%甲酸-乙腈作為提取溶劑。

2.2.3干燥劑的影響本實驗的前處理方法借鑒QuEChERS方法，簡化了其吸附劑的步驟，比較了使用無水MgSO4干燥和不使用干燥劑兩種情況下4種毒素的回收率。由于紅棗本身水分較少，因此兩種情況下4種毒素的回收率相差不大，均在90%以上。在不引入其他雜質(zhì)的情況下，選擇不使用干燥劑。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別用溶劑標準溶液和基質(zhì)空白標準溶液配制500 μg/L的4種毒素混合溶液。通過下式計算基質(zhì)效應(yīng)(ME)：ME=(S1-S2)/S2，式中S1為毒素標準品在基質(zhì)空白標準溶液中的平均峰面積，S2為毒素標準品在純?nèi)軇藴嗜芤褐械钠骄迕娣e。

結(jié)果表明，AME的ME為-4.65%，AOH的ME為-12.44%，TEN的ME為-1.56%，TEA的ME為-25.35%，在基質(zhì)空白標準溶液中未檢測到強烈的離子抑制(ME<-30%)。表明外標法可用于4種鏈格孢菌毒素的測定。

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1線性范圍與檢出限在優(yōu)化條件下，對一系列質(zhì)量濃度的混合標準溶液進行檢測。以質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子對的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結(jié)果見表2。由表2可見，AOH的線性范圍為1.0～100 μg/L，AME、TEA和TEN的線性范圍為10～1 000 μg/L，在此范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.990)。當信噪比S/N≥3時，TEN、AME、AOH和TEA的檢出限( LOD )為0.5～12.4 μg/kg。

表2 紅棗基質(zhì)中4種鏈格孢菌毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限(LODs)Table 2 Liner ranges，linear equations，correlation coefficients and limits of detection(LODs) of four alternaria mycotoxins in jujube

2.4.2回收率與相對標準偏差按優(yōu)化條件，在空白樣品基質(zhì)中進行3個水平(40、100、400 μg/kg)的加標回收實驗，每個加標水平平行實驗3次，測定4種鏈格孢菌毒素的加標回收率及相對標準偏差(RSD)。結(jié)果顯示，4種鏈格孢菌毒素的平均回收率為92.8%～116%，RSD為0.5%～11.2%，日間精密度為2.1%～12.3%，表明方法具有良好的準確度與精密度。

2.5 實際樣品的測定

采用本方法檢測10份新疆紅棗實際樣品，其中4份檢出鏈格孢菌毒素，AOH、AME、TEN和TEA的檢出量分別為0.048～5.050 mg/kg、LOD～11.770 mg/kg、LOD～0.320 mg/kg、1.205～1 070.300 mg/kg;其中TEA在紅棗中檢出量最高，與文獻報道一致[17-18]。

2.6 風(fēng)險評估

目前，全世界有80多個國家和地區(qū)制定了果品中真菌毒素的限量標準，但均未包括鏈格孢菌毒素[6]。鏈格孢菌毒素廣泛分布于果蔬食品中，其檢出率為25%～75%[19]。本研究在紅棗中檢出的最高含量達1 070.300 mg/kg，遠高于鏈格孢菌毒素在其他食品中的含量。高檢出率與高含量可能會存在潛在的健康隱患，因此本實驗基于T.E.S.T軟件和Toxtree軟件計算了4種鏈格孢菌毒素的毒理學(xué)評估數(shù)據(jù)(表3)。表3中TTC Class、Protein binding Alerts 和DNA binding Alerts由Toxtree軟件給出，生物蓄集系數(shù)(Bioaccumulation factor)和LD50由T.E.S.T軟件給出。LD50(man)根據(jù)LD50值使用等效劑量系數(shù)轉(zhuǎn)換的方法計算得到[20]。最大無效水平(The maximal no-effect level，NOEL)根據(jù)公式(1)得到，在此基礎(chǔ)上根據(jù)公式(2)得到允許每日暴露量(The permitted dailyexposure，PDE)[21-22]。

(1)

(2)

式中，BW表示成年人的體重，F(xiàn)1～F5均為不確定因子，在本研究中的取值依次為12、10、10、10、1。由表3可知，體重為60 kg的成年人的PDE范圍為19.30～25.65 μg/d，而TEA在紅棗中的最高含量高達1 070.300 mg/kg，雖然目前尚無中國人的飲食數(shù)據(jù)，但果品中鏈格孢菌毒素尤其是檢測含量最高的TEA確實存在健康隱患。同時，相對于TEA，雖然AOH和AME的含量較低，但AOH和AME具有遺傳毒性，其潛在危害亦不可忽視。

表3 4種鏈格孢菌毒素的毒理學(xué)評估Table 3 Toxicological assessment of four alternaria mycotoxins

3 結(jié) 論

本文利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法并結(jié)合簡化的QuEChERS技術(shù)，建立了快速檢測紅棗中TEA、AOH、TEN和AME 4種鏈格孢菌毒素的方法。該方法樣品前處理簡單，回收率均大于90%，基質(zhì)效應(yīng)小，具有操作簡便、快速、靈敏度高、檢出限低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，能滿足紅棗中鏈格孢菌毒素的檢測要求。同時運用毒理學(xué)軟件對4種鏈格孢菌毒素進行毒理學(xué)評估，發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌毒素對于人體具有潛在危害，值得關(guān)注。未來可擴大范圍測定其他果蔬中鏈格孢菌毒素含量，并結(jié)合中國人飲食數(shù)據(jù)，從而更加準確評估中國人鏈格孢菌毒素的日暴露量。