王雨晴，陳 亮，賈福懷，鄭 鋅，李月琪，馬 勇，張海欣，王 憬，谷瑞增

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心，北京 100015；2.寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012；3.島津企業(yè)管理(中國)有限公司，北京 100020)

肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸，Car)和鵝肌肽(β-丙氨酰-1-甲基-L-組氨酸，Ans)是動物體內(nèi)的組氨酸二肽。肌肽類生物活性肽具有抗氧化能力，可以抑制體內(nèi)脂質(zhì)氧化以及蛋白質(zhì)的氧化和糖基化，并具有抗衰老、抗白內(nèi)障等功能[1-6]，主要存在于脊椎動物的肌肉和大腦中，通常從家禽骨骼肌中提取[7]。天然提取肌肽和鵝肌肽可以滿足人們的保健需求，在特醫(yī)食品和保健食品領域已有應用。因此，建立快速、可靠的肌肽和鵝肌肽的檢測方法十分必要。

目前肌肽和鵝肌肽的檢測尚無相關國家標準，據(jù)文獻報道，組氨酸二肽類物質(zhì)的測定方法主要有高效液相色譜法、離子交換色譜法和毛細管電泳法。高效液相色譜法有效實現(xiàn)了肌肽和鵝肌肽的測定[8-9]，但該方法選用210 nm波長進行測定，基線較高、易受到干擾，方法準確度尚需考察。田穎剛等[10]用NH2柱分離測定肌肽含量并進行質(zhì)譜(MS)驗證，但利用液相色譜定量，目標物質(zhì)準確性有待進一步確定。Gil-Agustí等[11]利用毛細管液相色譜測定肉類樣品中的肌肽和鵝肌肽，該方法需高純試劑，成本高，且對樣品純度的要求很高，不利于肌肽和鵝肌肽含量的測定。利用離子交換色譜和毛細管電泳熒光檢測法分析肌肽和鵝肌肽含量的前處理較為復雜，對樣品分離純化要求較高，分離效果欠佳[12-13]。隨著分析技術的快速發(fā)展，利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對短肽進行定性定量成為主流趨勢[14-15]。

本文利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法，以分子離子和碎片離子質(zhì)荷比定性，建立了一種簡單、快速、可同時測定肌肽和鵝肌肽含量的方法，以滿足特醫(yī)食品、保健食品等領域動物源提取物中肌肽和鵝肌肽含量的分析要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀Nexera X2與三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)(日本島津公司)，包括：LC-30AD×2輸液泵，SIL-30AC自動進樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器，LCMS-8060三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver.5.91色譜工作站。XS205DU分析天平(美國Mettler Toledo公司)；QL-901渦旋混合儀(其林貝爾儀器制造有限公司)。

標準品：肌肽購于Sigma公司，鵝肌肽購于蘇州強耀生物科技有限公司，純度均≥99%；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲醇(色譜純，美國J.T.Backer公司)；甲酸(色譜純，迪馬科技有限公司)；乙酸(>99.99%，Sigma公司)；乙酸銨(質(zhì)譜純，Sigma公司)；實驗所用超純水(18.2 MΩ·cm)由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

1.2 多肽標準品的配制

分別準確稱取肌肽及鵝肌肽標準品粉末20.0 mg，加水溶解，渦旋混勻，定容至100 mL，即得200 mg/L的標準儲備液。分別取500 μL上述標準儲備液，定容至10 mL，即得10 mg/L的混合標準中間工作液。將上述混合標準中間工作液用水逐級稀釋成1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500 μg/L的系列標準工作溶液。

1.3 肌肽、鵝肌肽提取物的制備

以富含肌肽和鵝肌肽的海洋魚和家禽為原料，先進行破碎和調(diào)漿，調(diào)節(jié)溫度和pH值至最佳反應條件進行攪拌提取，離心后取上清液，濃縮后冷凍干燥，制成固體粉末狀低聚肽提取物樣品，分別為海洋魚低聚肽樣品A、B和家禽低聚肽樣品A、B、C、D。

1.4 樣品前處理

將“1.3”所述以海洋魚和家禽為原料制備的6個低聚肽樣品，用水分別配成20.0 g/L的溶液，以水稀釋104倍待測。

1.5 分析條件

液相色譜條件：Inertsil Amide HP(2.1 mm×100 mm,3 μm)色譜柱；流動相：A為0.1% 乙酸水溶液，B為乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～3.0 min,70%～55%B;3.0～4.0 min,55%B;4.0～4.2 min,55%～70%B;流速：0.4 mL/min；進樣體積：1 μL；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化模式：ESI+；離子噴霧電壓：4.5 kV；霧化氣(氮氣)流速：3.0 L/min；加熱氣(空氣)流速：10 L/min；干燥氣(氮氣)流速：10 L/min；脫溶劑管溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；離子源溫度：300 ℃；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)；駐留時間：100 ms；延遲時間：3 ms；MRM參數(shù)見表1。

表1 目標化合物的MRM優(yōu)化參數(shù)Table 1 The multiple reaction monitoring conditions of the analytes

*quantitative ions

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

肌肽和鵝肌肽均含有氨基，在酸性條件下易加氫形成[M+H]+，因此實驗選擇ESI+模式分別對1 mg/L肌肽及鵝肌肽混合標準溶液進行一級全掃描，得到豐度較高且穩(wěn)定的前體離子，再利用儀器自動優(yōu)化功能，篩選出二級產(chǎn)物離子信息，獲得產(chǎn)物離子和碰撞能量(CE)。結果表明，肌肽的酰胺鍵斷裂可得到m/z156.1的產(chǎn)物離子，組氨酸殘基脫羧得到m/z110.1的產(chǎn)物離子；鵝肌肽酰胺鍵斷裂得到m/z170.1的產(chǎn)物離子，經(jīng)脫羧和脫氨基得到m/z109.1的產(chǎn)物離子。一級質(zhì)譜及二級質(zhì)譜圖見圖1，肌肽和鵝肌肽的裂解途徑見圖2。肌肽選擇m/z227.1>110.1和227.1>156.1為檢測離子對，鵝肌肽選擇m/z241.1>109.1和241.1>170.1為檢測離子對，其他MRM檢測參數(shù)見表1。

圖1 肌肽和鵝肌肽混標的一級(A)、二級(B,C)質(zhì)譜圖Fig.1 Precursor ions(A) and product ions(B,C) spectra of carnosine and anserineA.carnosine and anserine,B.carnosine,C.anserine

圖2 肌肽和鵝肌肽的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 MS fragmentation pathways of carnosine and anserine

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1色譜柱的選擇肌肽和鵝肌肽均屬于極性親水化合物，在常規(guī)C18色譜柱上很難保留，且二者的分子結構只相差1個甲基，極性差異較小，分離難度大。本實驗比較了親水性色譜柱CORTECS HILIC(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)、Inertsil Amide HP(2.1 mm×100 mm,3 μm)以及適合極性化合物保留的反相色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)對肌肽和鵝肌肽的分離效果。結果表明，T3反相色譜柱對肌肽和鵝肌肽難以實現(xiàn)保留；另兩種親水性色譜柱對肌肽和鵝肌肽均有保留，且Inertsil Amide HP柱保留時間的穩(wěn)定性更優(yōu)，因此實驗選擇Inertsil Amide HP(2.1 mm×100 mm,3 μm)色譜柱進行分離。

圖3 肌肽及鵝肌肽標準溶液(1.95 μg/L)的定量離子流色譜圖Fig.3 Quantitative ion chromatograms of standard solution(1.95 μg/L)

2.2.2流動相的優(yōu)化比較了甲醇-水、乙腈-水及流動相中添加不同調(diào)節(jié)劑的分離效果。結果顯示，以甲醇為有機相時目標化合物難以實現(xiàn)保留，而以乙腈為有機相時，目標化合物的色譜峰形好、保留時間穩(wěn)定，因此實驗選用乙腈作為有機相。在正離子化模式下，流動相中加入酸性介質(zhì)有利于化合物的離子化，可增強目標物的色譜峰響應；加入緩沖鹽也有助于增加化合物的電離效果。因此，考察了流動相中分別加入1 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸和0.1%乙酸的分離效果。結果表明，流動相中加入乙酸銨后色譜峰響應減弱；而加入0.1%乙酸較加入0.1%甲酸的色譜峰響應更高，峰形更對稱，且分離度和靈敏度均能滿足測定要求。綜上，實驗選擇乙腈和0.1%乙酸作為流動相，此時目標物的檢測靈敏度高，分離度好，且能有效改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象。

在優(yōu)化的UHPLC-MS/MS條件下，混合標準溶液中肌肽和鵝肌肽的分離效果良好(圖3)。

2.3 系統(tǒng)殘留測試

在高濃度低聚肽樣品(500 μg/L)進樣后，進樣空白溶劑，考察肌肽及鵝肌肽的系統(tǒng)殘留情況。結果表明，高濃度低聚肽樣品分析后，系統(tǒng)無殘留現(xiàn)象。

2.4 線性范圍及靈敏度實驗

將“1.2”所述系列濃度標準工作溶液(1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500 μg/L)在優(yōu)化條件下進行測定，外標法定量。以質(zhì)量濃度(X,μg/L)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，肌肽和鵝肌肽的質(zhì)量濃度在1.95～500 μg/L范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)(r)均高于0.998。以3倍信噪比(S/N=3)計算檢出限(LOD)，以S/N=10計算定量下限(LOQ)，得肌肽和鵝肌肽的LOD分別為0.12、0.47 μg/L，LOQ分別為0.37、1.42 μg/L(表2)。

表2 肌肽和鵝肌肽的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)(r)、檢出限及定量下限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of carnosine and anserine

2.5 回收率與精密度

根據(jù)預實驗的結果，選擇肌肽及鵝肌肽含量相對較低的低聚肽樣品作為基質(zhì)。取10 μL不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液，加入一定量的低濃度基質(zhì)，配制成2、20、200 μg/L加標濃度，每個濃度平行6份。根據(jù)標準曲線測定結果，計算加標回收率(表3)。得肌肽的回收率為99.3%～109%，相對標準偏差(RSD，n=6)為0.98%～1.1%；鵝肌肽的回收率為100%～113%，RSD為1.0%～1.1%。

表3 加標回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of spiked samples(n=6)

表4 實際樣品的測定結果Table 4 Analytical results of real samples

2.6 實際樣品的測定

取“1.3”自制的6個低聚肽樣品，在優(yōu)化條件下進行測定，典型樣品家禽低聚肽樣品B的色譜圖見圖4，各低聚肽樣品中肌肽和鵝肌肽的含量測定結果見表4。結果表明，相同低聚肽樣品中鵝肌肽的含量均高于肌肽，以家禽為原料提取的低聚肽樣品中肌肽和鵝肌肽的含量均高于以海洋魚為原料提取的低聚肽樣品。

圖4 家禽低聚肽樣品B的色譜圖Fig.4 Chromatograms of poultry sample B

3 結 論

本研究利用UHPLC-ESI-MS/MS技術，建立了動物源提取物中肌肽及鵝肌肽的測定方法。結果表明，肌肽和鵝肌肽在1.95～500 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，檢出限分別為0.12、0.47 μg/L。該方法回收率高、精密度良好、準確度高，能滿足肌肽及鵝肌肽的定量測定要求。本方法對于特醫(yī)食品、保健食品和藥食同源類產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)具有重要意義。