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1.海南省藥物研究所，海南 ?？?570311；2.海南省中醫(yī)院，海南 海口 570216

糖尿病腎病作為一種由糖尿病引發(fā)的并發(fā)癥，在發(fā)達(dá)國家占到了所有腎功能衰竭病例中的30%～40%[1]，由于2型糖尿病的人數(shù)增加，2型糖尿病腎病的發(fā)生數(shù)也逐年上升，其中20歲以上的糖尿病患病率高達(dá)9.7%，2013在我國糖尿病人數(shù)為9840萬，居全球首位[2]。因此防控2型糖尿病腎病的形勢可謂十分嚴(yán)峻?！白唐⑼ńj(luò)湯”在海南省中醫(yī)院長期作為院內(nèi)制劑使用，為控制2型糖尿病早期腎病藥物，療效在臨床已得到證實(shí)[3]，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證經(jīng)過干燥制粒后的“滋脾通絡(luò)顆粒”是否仍有藥物功效，同時通過對大鼠2型糖尿病腎病模型的效果更直觀的考察藥物對大鼠腎臟的作用情況。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 受試藥物 滋脾通絡(luò)顆粒(8 g/袋，由黃芪、當(dāng)歸、赤芍、山藥、牛膝、大黃、鬼箭羽、三七、水蛭、甘草水提液加輔料干燥制成，批號：20170801，海南省中醫(yī)院提)；鹽酸二甲雙胍緩釋片(批號：170807，山東司邦得制藥有限公司)。

1.2 動物 SPF級SD大鼠，雄性，55只，體重(180±20)g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(湘)2014-0011，動物飼養(yǎng)于海南省藥物研究所SPF動物房，使用許可證號：SYXK(瓊)2014-0025。

1.3 儀器 大鼠代謝籠，Accu-Chek Performa血糖儀(羅氏)，ST-360酶標(biāo)儀(KHB)，WD-2103A洗板機(jī)，Eclipse 50i顯微鏡(Nikon )，7100 Automatic Analyzer血生化儀(Hitachi )，病理切片設(shè)備(Leica RM2235，EG1150H，EG1150C，HI1210/1220，TP1020)。

1.4 材料 ELISA試劑盒(批號：170711，上海恒遠(yuǎn))，血生化試劑(Wako DF769，DG501)。

2 方法

2.1 模型動物的制備及分組 根據(jù)適用癥模型，選擇大鼠2型糖尿病模型進(jìn)行造模，造模方式為鏈脲佐菌素(STZ)輔以高脂飼料喂養(yǎng)[4]。SD大鼠先以高脂飼料喂養(yǎng)21 d，禁食不禁水12 h，稱量大鼠體重，并按照體重將STZ以25 mg/kg小劑量腹腔注射(i.p.)。注射完成后正常飲水，并繼續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)。于14 d測量空腹血糖(禁食8 h)，選取血糖濃度高于15 mol/L的大鼠。繼續(xù)喂養(yǎng)14 d，收集24 h全尿液，尿白蛋白含量高于5 mg/d的大鼠可認(rèn)為發(fā)生早期腎病[5]。

將2型糖尿病早期腎病成模大鼠50只隨機(jī)分為5組，每組10只。分別為滋脾通絡(luò)給藥高、中、低劑量組，二甲雙胍組，模型組。

2.2 給藥及劑量 根據(jù)長期毒性試驗(yàn)劑量確定本次藥效學(xué)研究劑量為7.5 g/kg，給藥中劑量組及低劑量組分別為高劑量組劑量的1/2及1/4，即3.75 g/kg及1.88 g/kg(以成品計(jì)算)。高中低3個劑量組設(shè)置分別為60 kg人用劑量的9.37、4.69及2.34倍；若按照體表面積折算，則是相對大鼠等效劑量的1.52、0.76及0.38倍[3]。陽性藥鹽酸二甲雙胍緩釋片依據(jù)人用劑量平均1 g/d·60 kg折合為大鼠等效劑量約為1.0 g/kg(0.5 g×2片/60 kg×6.17系數(shù)≈1.0 g/kg)，按照大鼠日均飲水量磨碎后放入飲水中稀釋，由大鼠自由飲取，每日更換新配藥物飲水。模型組給予等體積生理鹽水，滋脾通絡(luò)3個劑量組均按照15 mL/kg體積灌胃給藥。

2.3 觀察指標(biāo) 每周測量一次大鼠體重及空腹血糖(FBG)，比較各組大鼠差異。連續(xù)灌胃給藥6周后，收集大鼠24 h尿液測尿白蛋白(UAER)；尿肌酐(Ucr)含量，麻醉大鼠腹主動脈取血測血清肌酐(Scr)，血清尿素氮(BUN)，利用公式求校正的內(nèi)生肌酐清除率，公式如下：

內(nèi)生肌酐清除率=(尿肌酐濃度×每分鐘尿量)/血清肌酐濃度得到的結(jié)果除以大鼠體重即為每kg體重的肌酐清除率(Ccr)。

采集血清后，取大鼠雙側(cè)腎臟，10%甲醛溶液(福爾馬林)固定，切片，HE染色法染色，觀察光鏡下的腎小球，腎小管病變情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，方差齊以Dunnett-t檢驗(yàn)各組與對照組之間的差異水平，方差不齊以Dunnett-T3檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠體重的影響 除二甲雙胍組體重仍有增加外，其余各組體重均不同程度減輕。在第6周之后，滋脾通絡(luò)顆粒給藥高劑量組與模型組相比，體重增加差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。滋脾通絡(luò)中劑量和低劑量相比模型組則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性藥鹽酸二甲雙胍對照組大鼠體重則在整個實(shí)驗(yàn)期間與模型組相比均有顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 滋脾通絡(luò)顆粒對大鼠體重的影響 ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.2 對大鼠FBG的影響 滋脾通絡(luò)高、中劑量組分別在給藥第3周、第4周FBG明顯降低，和模型組同期FBG相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，至第6周與同期模型組大鼠相比，F(xiàn)BG值降低具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。滋脾通絡(luò)顆粒低劑量給藥組試驗(yàn)全程未見與模型組FBG的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表2。

表2 滋脾通絡(luò)顆粒對大鼠FBG的影響 ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.3 對大鼠Scr、BUN、UAER、Ccr的影響 滋脾通絡(luò)高劑量給藥組無論Scr、BUN、UAER均較模型組低，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，滋脾通絡(luò)顆粒中劑量給藥組Scr及UAER亦均較模型組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BUN與模型組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。低劑量組與模型組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P﹥0.05)。滋脾通絡(luò)顆粒高劑量組能夠顯著降低Ccr(P<0.05)，其余各組與模型組相同。見表3。

表3 對大鼠Scr、BUN、UAER、Ccr的影響 ±s)

注：與模型組比較，*P<0.05、**P<0.01。

3.4 對大鼠腎切片外觀的影響 由HE染色的腎小球切片可以看到，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞明顯擴(kuò)張，胞漿疏松，出現(xiàn)水腫；腎小球體積明顯增大，基底膜增厚，腎小球囊擠壓消失。滋脾通絡(luò)顆粒低劑量組與模型組表現(xiàn)相似，均出現(xiàn)明顯DN特征。滋脾通絡(luò)給藥高劑量組與陽性藥物鹽酸二甲雙胍緩釋片組大鼠腎小球體積，腎小管上皮細(xì)胞較模型組均有明顯緩解。滋脾通絡(luò)中劑量組也有緩解DN癥狀特點(diǎn)。見圖1。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明滋脾通絡(luò)顆粒能夠明顯緩解糖尿病大鼠腎小球肥大等早期DN的主要病理改變，通過實(shí)驗(yàn)可見滋脾通絡(luò)顆粒能夠穩(wěn)定空腹血糖在一個相對較低的水平，起到緩解腎臟負(fù)擔(dān)，控制早期DN繼續(xù)發(fā)展的趨勢。經(jīng)滋脾通絡(luò)顆粒治療的大鼠無論尿量還是每日的尿白蛋白含量均低于模型組DN大鼠，Scr及BUN含量也較DN模型組大鼠更低。經(jīng)大鼠體重校正后的Ccr結(jié)果表明，與人類腎病發(fā)生后Ccr較正常值降低相反，腎病大鼠Ccr升高，這也與許多文獻(xiàn)中報道的一致[7-9]，但具體是何原因?qū)е麓笫驝cr與人類Ccr表象相反仍不清楚其中機(jī)理。經(jīng)治療后的大鼠Ccr較模型組低，滋脾通絡(luò)高劑量組能顯著降低Ccr水平。

處方中黃芪味甘性溫為補(bǔ)氣要藥，取其大補(bǔ)脾胃之元?dú)猓箽馔灾?；山藥甘平，歸脾肺腎經(jīng),既補(bǔ)三臟之氣，又滋其陰，二藥相合，氣血雙補(bǔ)，相配為君。當(dāng)歸、赤芍、川牛膝活血而不傷正，補(bǔ)血而不滯血。其中黃芪、山藥、牛膝、大黃、水蛭成分可能具有抑制系膜細(xì)胞凋亡的作用[10]，黃芪、當(dāng)歸、赤芍、山藥、牛膝、大黃、水蛭、甘草等的配伍具有益氣活血利水作用，能夠消退水腫，減少蛋白尿，延緩腎功能衰竭的速度[11]。鬼箭羽具有降低全血粘度，降低血糖，雙向調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[12]。綜上，本處方藥物在降糖，消水腫，降低蛋白尿等多方面作用于糖尿病早期腎病，具有綜合的延緩糖尿病早期腎病病程作用。