楊永恒， 侯孟蘭， 張永俠， 徐曉洋， 孫玉明， 張 婷， 原海燕

〔江蘇省中國科學(xué)院植物研究所(南京中山植物園)， 江蘇 南京 210014〕

甜菊(SteviarebaudianaBertoni)又稱甜葉菊，隸屬于菊科(Asteraceae)甜菊屬(SteviaCav.)，為多年生宿根性草本植物，原產(chǎn)于南美洲，因其葉片含有高甜度、低熱量的甜菊糖苷而聞名[1]。甜菊為異花授粉植物，具有自交不親和性，自交結(jié)實率低于0.5%[2-3]，因此，通過多代自交獲得純合種質(zhì)的難度較大，阻礙了自交系和純合體在甜菊遺傳育種中的研究和應(yīng)用。在長期育種實驗過程中，作者發(fā)現(xiàn)部分甜菊品種自交授粉后可以形成幼胚，但可能因受精后障礙導(dǎo)致幼胚敗育無法形成成熟的種子。胚挽救技術(shù)為克服受精后障礙的有效方法[4]，在新種質(zhì)創(chuàng)制和新品種培育中得到迅速發(fā)展，加快了植物育種進(jìn)程。該技術(shù)已在小麥屬(TriticumLinn.)[4-5]、葡萄屬(VitisLinn.)[6-7]、柑橘屬(CitrusLinn.)[8]、百合屬(LiliumLinn.)[9-10]、苜蓿屬(MedicagoLinn.)[11]和菊屬(ChrysanthemumLinn.)[12-15]等植物的遠(yuǎn)緣雜交、多倍體育種和自交系育種等研究中有成功報道。

本研究首次嘗試?yán)门咄炀燃夹g(shù)進(jìn)行甜菊自交種質(zhì)創(chuàng)制，通過對甜菊不同品種自交授粉后早期有胚率進(jìn)行統(tǒng)計，篩選適合胚挽救的甜菊品種，并對胚挽救的取材時期和培養(yǎng)基等進(jìn)行研究，以期建立甜菊胚挽救的技術(shù)體系，并為甜菊純合種質(zhì)創(chuàng)制、新品種培育及育種進(jìn)程加快奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試6個甜菊品種中，‘中山5號’(‘Zhongshan No. 5’)、‘中山6號’(‘Zhongshan No. 6’)和‘中山8號’(‘Zhongshan No. 8’)為作者所在課題組自主選育，‘江甜2號’(‘Jiangtian No. 2’) 引種自中國江蘇東臺，‘譜星1號’(‘PC Star No. 1’)引種自中國江西贛州，‘守田3號’(‘Morita No. 3’) 引種自日本。所有品種活植物保存于江蘇省中國科學(xué)院植物研究所甜菊種質(zhì)資源圃，于2017年4月扦插繁殖，生根后移栽到花盆(上口徑20.0 cm、底徑14.5 cm、高20.0 cm)中，每盆1株，每品種10盆，置于日光溫室并進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)。

1.2 方法

1.2.1 自交親本選擇 于2017年8月至10月(甜菊花期)在日光溫室進(jìn)行6個甜菊品種的自交實驗，選取健壯且花蕾多的枝條，用硫酸紙袋套袋隔離，開花后取同株花粉授于成熟柱頭上，授粉后立即套袋并掛牌標(biāo)記授粉日期，每隔1 d授粉1次。每個品種授粉約500個頭狀花序。分別隨機(jī)取各品種自交授粉后5、10、15和20 d的頭狀花序各20個，用鑷子取出全部子房，并用解剖針剝出幼胚，統(tǒng)計幼胚數(shù)。實驗重復(fù)3次。根據(jù)公式“有胚率=(幼胚數(shù)/調(diào)查子房總數(shù))×100%”計算有胚率。篩選有胚率高的品種作為自交親本，以獲得足量幼胚進(jìn)行后續(xù)胚挽救體系建立和S1代性狀分析實驗。

1.2.2 胚挽救方法 分別采集甜菊品種‘中山8號’自交授粉后1、3、5、7和9 d的花，保濕并暫時保存于4 ℃冰箱。接種前將花用流水沖洗30 min，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸潤30 s后轉(zhuǎn)移到超凈工作臺中，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%HgCl2溶液浸泡4～5 min，無菌水漂洗3次，置于無菌濾紙上吸干表面水分，用解剖針從子房中剝出胚珠或幼胚，分別接種于MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加2.0 mg·mL-16-BA和2.0 mg·mL-1NAA的MS培養(yǎng)基)和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加2.0 mg·mL-16-BA和0.2 mg·mL-1NAA的MS培養(yǎng)基)上，3種培養(yǎng)基均含40 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，pH 5.8。將授粉后不同天數(shù)的胚珠或幼胚分別接種于3種培養(yǎng)基上，各3皿，每皿60枚。接種后置于溫度25 ℃、光照時間16 h·d-1、光照度1 500～2 000 lx的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察并統(tǒng)計其萌發(fā)情況。

1.2.3 自交S1代幼苗管理和主要性狀分析方法

1.2.3.1 幼苗管理 胚挽救培養(yǎng)2周后，待幼苗長至2對真葉時從培養(yǎng)基中取出，用無菌水洗凈根部，移栽到育苗缽(上口徑10.0 cm、底徑6.5 cm、高8.0 cm)中，栽培基質(zhì)為混合均勻的營養(yǎng)土和泥炭(體積比1∶1)，株間距1.0～1.5 cm，覆蓋保鮮膜保濕，置于溫度25 ℃、光照時間16 h·d-1、光照度1 500～2 000 lx的人工氣候箱內(nèi)，培養(yǎng)1周后揭去保鮮膜，繼續(xù)培養(yǎng)2周后移栽到小花盆(上口徑7.0 cm、底徑3.5 cm、高8.0 cm)中，栽培基質(zhì)同上，每盆1株，培養(yǎng)2個月后，待植株長至8～10對真葉時進(jìn)行短日照(光照時間10 h·d-1)處理，其他培養(yǎng)條件不變。

1.2.3.2 現(xiàn)蕾期統(tǒng)計 短日照處理后每天觀察植株，統(tǒng)計植株的現(xiàn)蕾期，即從短日照處理開始至現(xiàn)蕾的天數(shù)。

1.2.3.3 甜菊糖苷含量測定 分別收集各現(xiàn)蕾植株地上部分的全部葉片，105 ℃殺青15 min后，70 ℃烘干至恒質(zhì)量。用研缽將干葉研成細(xì)粉，準(zhǔn)確稱取0.200 0 g粉末，置于離心管中，加入10 mL蒸餾水，于沸水浴中提取2 h，然后于室溫、4 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液，使用孔徑0.22 μm濾膜過濾后，按照GB 8270—2014中HPLC法測定和計算各樣品的甜菊糖苷含量，采用LC-100高效液相色譜儀(上海伍豐科學(xué)儀器有限公司)和Sapphire C18反相色譜柱(蘇州賽分科技有限公司，250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為V(乙腈)∶V(磷酸鈉緩沖液)=32∶68；流速1.0 mL·min-1，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃。實驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用EXCEL 2010 和SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果和分析

2.1 自交授粉后甜菊不同品種的有胚率分析

自交授粉后不同天數(shù)甜菊各品種的有胚率見表1。結(jié)果顯示：自交授粉后5 d，甜菊不同品種間有胚率的差異明顯，其中，‘中山8號’的有胚率最高，為16.0%；其次為‘中山5號’，有胚率為12.1%；‘江甜2號’、‘譜星1號’和‘守田3號’的有胚率較低，分別為8.0%、6.0%和2.8%。自交授粉后10 d，‘中山8號’和‘中山5號’的有胚率均較授粉后5 d明顯降低，分別為2.0%和1.0%；其他品種的有胚率均為0.0%；自交授粉后15和20 d，甜菊6個品種的有胚率均為0.0%。

品種Cultivar自交授粉后不同天數(shù)的有胚率/% Embryo rate at different days after self-crossing pollination5 d10 d15 d20 d中山5號Zhongshan No. 512.1±2.7a1.0±0.8a0.0±0.0a0.0±0.0a中山6號Zhongshan No. 60.0±0.0d0.0±0.0b0.0±0.0a0.0±0.0a中山8號Zhongshan No. 816.0±2.2a2.0±1.6a0.0±0.0a0.0±0.0a江甜2號Jiangtian No. 28.0±1.6b0.0±0.0b0.0±0.0a0.0±0.0a譜星1號PC Star No. 16.0±1.4b0.0±0.0b0.0±0.0a0.0±0.0a守田3號Shoutian No. 32.8±1.0c0.0±0.0b0.0±0.0a0.0±0.0a

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

2.2 自交授粉后甜菊品種‘中山8號’胚珠和幼胚在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分析

自交授粉后不同天數(shù)甜菊品種‘中山8號’胚珠和幼胚在3種培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間見表2。結(jié)果顯示：隨自交授粉后天數(shù)的增加，‘中山8號’胚珠和幼胚在3種培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間越來越短。自交授粉后1 d的胚珠在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上均不萌發(fā)；自交授粉后3 d的胚珠在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間分別為9.4、8.9和9.2 d，三者間差異不顯著；自交授粉后5 d的幼胚在上述3種培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間分別為4.8、4.8和5.4 d，三者間差異不顯著；自交授粉后7 d的幼胚在上述3種培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間分別為3.5、4.0和3.9 d，三者間差異不顯著；自交授粉后9 d的幼胚在上述3種培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間分別為3.7、2.9和3.5 d，幼胚在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)時間較短，與其他2種培養(yǎng)基間差異顯著。

培養(yǎng)基Medium自交授粉后不同天數(shù)胚珠的萌發(fā)時間/dGermination time of ovule at different days after self-crossing pollination自交授粉后不同天數(shù)幼胚的萌發(fā)時間/dGermination time of embryo at different days after self-crossing pollination1 d3 d5 d7 d9 dMS培養(yǎng)基MS medium—9.4±1.0a4.8±0.2ab3.5±0.5ab3.7±0.4a愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基Callus induction medium—8.9±0.9a4.8±0.5ab4.0±0.1a2.9±0.1b分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基Differentiation induction medium—9.2±1.0a5.4±0.4a3.9±0.1a3.5±0.5a

1)—： 未萌發(fā)No germination. 同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

自交授粉后不同天數(shù)甜菊品種‘中山8號’胚珠和幼胚在3種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率見表3。結(jié)果顯示：隨自交授粉后天數(shù)的增加，‘中山8號’胚珠和幼胚在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率均呈逐漸升高的變化趨勢。自交授粉后1 d的胚珠在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率均為0.0%；自交授粉后3 d的胚珠在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別為32.8%、38.4%和20.5%，三者間存在顯著差異；自交授粉后5 d的幼胚在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別為55.6%、50.3%和45.1%，三者間存在顯著差異；自交授粉后7 d的幼胚在MS培養(yǎng)基、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率較自交授粉后5 d明顯升高，分別為83.3%、79.6%和66.3%，且在MS培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率均顯著高于在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率；自交授粉后9 d的幼胚在MS培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率均大于80%，顯著高于在分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率(76.8%)。

培養(yǎng)基Medium自交授粉后不同天數(shù)胚珠的萌發(fā)率/%Germination rate of ovule at different days after self-crossing pollination自交授粉后不同天數(shù)幼胚的萌發(fā)率/%Germination rate of embryo at different days after self-crossing pollination1 d3 d5 d7 d9 dMS培養(yǎng)基MS medium0.0±0.0a32.8±3.1b55.6±1.7a83.3±2.2a80.4±4.5a愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基Callus induction medium0.0±0.0a38.4±4.2a50.3±2.6b79.6±3.0a81.2±3.2a分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基Differentiation induction medium0.0±0.0a20.5±2.3c45.1±1.2c66.3±2.7b76.8±2.5b

1)同列中不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

2.3 甜菊自交S1代植株主要性狀比較

2.3.1 現(xiàn)蕾期分析 短日照處理胚挽救獲得的甜菊品種‘中山8號’103株自交S1代植株現(xiàn)蕾期的統(tǒng)計結(jié)果(圖1)表明：‘中山8號’自交S1代植株間現(xiàn)蕾期的差異較大。其中，3.9%的植株現(xiàn)蕾較早，短日照處理10 d即現(xiàn)蕾；最晚的1株在短日照處理46 d現(xiàn)蕾。短日照處理15 d現(xiàn)蕾的植株最多，占植株總數(shù)的16.5%。

2.3.2 甜菊糖苷含量分析 甜菊品種‘中山8號’及其103個自交S1代植株現(xiàn)蕾期葉片中甜菊糖苷含量的比較結(jié)果見表4。結(jié)果表明：在現(xiàn)蕾期，103個自交S1代植株葉片中萊鮑迪苷A(RA)、甜菊苷(ST)、萊鮑迪苷C(RC)、杜爾可苷A(DA)和總甜菊糖苷(TSG)含量分別為0.26%～11.43%、0.36%～6.45%、1.52%～9.18%、0.05%～1.40%和5.80%～16.90%，變化范圍較大；各甜菊糖苷含量占TSG含量的比例變化范圍也較大，其中，RA、ST、RC和DA含量占TSG含量的比例分別為3.19%～72.06%、3.20%～46.98%、12.59%～74.27%和0.53%～12.33%。在‘中山8號’及其103個自交S1代植株中，‘中山8號’和9個植株均為高RA型(RA含量占TSG含量的比例大于60.00%)，編號分別為ZS8-8、ZS8-40、ZS8-53、ZS8-59、ZS8-64、ZS8-66、ZS8-84、ZS8-99和ZS8-102；7個植株為高RA-RC型(RA和RC含量占TSG含量的比例均大于40.00%)，編號分別為ZS8-9、ZS8-12、ZS8-13、ZS8-38、ZS8-65、ZS8-78和ZS8-89；11個植株為高RC型(RC含量占TSG含量的比例大于60.00%)，編號分別為ZS8-4、ZS8-15、ZS8-24、ZS8-25、ZS8-44、ZS8-46、ZS8-57、ZS8-63、ZS8-69、ZS8-74和ZS8-82；編號為ZS8-30的自交S1代植株為高RA-RC-DA型，其RA、RC和DA的含量占TSG含量的比例分別為35.68%、38.26%和12.33%。

圖1 短日照處理下甜菊品種‘中山8號’自交S1代植株現(xiàn)蕾期的比較Fig. 1 Comparison on budding stage of self-crossing S1 progeny plant of cultivar ‘Zhongshan No. 8’ of Stevia rebaudiana Bertoni under short-day treatment

品種(編號)Cultivar(No.)各甜菊糖苷的含量/%Content of each steviol glycoside各甜菊糖苷含量占總甜菊糖苷含量的比例/%Percentage of each steviol glycoside content to total steviol glycoside contentRASTRCDATSGRASTRCDAZS810.57±0.381.59±0.093.90±0.210.24±0.0116.30±0.6964.85±0.429.75±0.1523.91±0.291.49±0.02ZS8-17.36±0.271.76±0.055.43±0.190.23±0.0114.77±0.4249.82±0.2311.89±0.1036.76±0.201.52±0.02ZS8-25.30±0.091.47±0.046.08±0.120.42±0.0213.27±0.3139.92±0.1811.05±0.0945.83±0.103.19±0.10ZS8-36.56±0.231.58±0.053.03±0.030.42±0.0111.58±0.2756.66±0.1713.61±0.1226.12±0.113.60±0.03ZS8-41.62±0.020.78±0.037.38±0.120.97±0.0110.76±0.2115.09±0.127.29±0.1068.60±0.219.01±0.03ZS8-50.74±0.011.61±0.053.70±0.070.65±0.026.70±0.1011.06±0.0824.05±0.2355.26±0.309.64±0.16ZS8-61.60±0.026.35±0.126.34±0.051.40±0.0315.69±0.2510.20±0.2240.48±0.3140.41±0.278.91±0.06ZS8-73.88±0.011.04±0.014.92±0.030.48±0.0110.31±0.1037.60±0.1810.06±0.0947.67±0.254.67±0.07ZS8-89.38±0.031.27±0.023.30±0.120.60±0.0114.55±0.0864.45±1.028.75±0.1222.66±0.124.15±0.02ZS8-95.82±0.022.14±0.025.91±0.070.08±0.0113.95±0.1241.74±0.0515.35±0.0742.33±0.140.57±0.09ZS8-105.61±0.013.01±0.054.47±0.020.60±0.0213.70±0.1040.95±0.1321.99±0.2232.65±0.074.41±0.08ZS8-117.68±0.101.96±0.035.14±0.050.23±0.0115.00±0.2351.18±0.1613.06±0.0534.25±0.091.50±0.10ZS8-125.84±0.031.61±0.015.25±0.020.21±0.0112.90±0.1445.24±0.0912.47±0.1240.68±0.201.62±0.05ZS8-136.20±0.051.53±0.026.12±0.110.21±0.0314.07±0.3244.07±0.1210.90±0.0643.50±0.341.53±0.06ZS8-142.57±0.021.76±0.034.66±0.050.05±0.019.03±0.0928.45±0.0919.45±0.1251.53±0.210.58±0.05ZS8-151.81±0.011.27±0.026.70±0.010.22±0.0210.01±0.0818.11±0.0612.72±0.0566.98±0.112.18±0.07ZS8-164.64±0.031.32±0.023.76±0.090.05±0.029.77±0.1247.45±0.2313.54±0.1538.48±0.110.53±0.05ZS8-178.33±0.051.72±0.015.77±0.060.27±0.0216.09±0.1451.78±0.3710.71±0.1035.84±0.211.67±0.12ZS8-187.46±0.122.66±0.044.50±0.100.23±0.0314.85±0.0950.24±0.4517.90±0.1230.30±0.231.55±0.07ZS8-192.86±0.151.58±0.013.81±0.070.76±0.059.00±0.1331.77±0.2517.51±0.1742.26±0.328.46±0.15ZS8-208.62±0.252.23±0.133.94±0.120.20±0.0914.99±0.2657.49±0.3414.90±0.1526.26±0.101.36±0.07ZS8-218.61±0.162.33±0.024.34±0.200.68±0.0315.97±0.2553.95±0.3314.60±0.1727.19±0.124.26±0.10ZS8-227.80±0.102.23±0.035.14±0.170.49±0.0515.67±0.1249.79±0.2314.25±0.1532.82±0.203.14±0.09ZS8-235.26±0.081.42±0.023.97±0.070.73±0.0511.38±0.1046.27±0.1812.45±0.0734.87±0.136.41±0.20ZS8-241.98±0.050.36±0.045.21±0.120.20±0.087.75±0.1225.59±0.054.60±0.1067.25±0.272.56±0.15ZS8-251.41±0.030.54±0.025.28±0.080.63±0.027.85±0.1017.91±0.056.86±0.0367.27±0.127.97±0.08ZS8-264.57±0.071.82±0.012.85±0.010.93±0.0110.16±0.5044.96±0.0517.89±0.1228.03±0.129.12±0.10ZS8-273.71±0.054.15±0.077.38±0.130.84±0.0216.08±0.1623.08±0.1625.79±0.2045.91±0.335.22±0.10ZS8-283.96±0.033.48±0.122.18±0.080.82±0.0510.45±0.1337.94±0.2333.31±0.3420.87±0.147.88±0.10ZS8-295.51±0.122.14±0.145.08±0.230.39±0.0713.13±0.4541.96±0.2416.32±0.3038.72±0.453.00±0.09ZS8-303.61±0.041.39±0.023.88±0.031.25±0.0110.13±0.0535.68±0.1213.73±0.1038.26±0.1312.33±0.08ZS8-318.34±0.080.45±0.015.17±0.040.12±0.0214.08±0.0659.21±0.113.20±0.0836.71±0.100.87±0.06ZS8-322.14±0.050.49±0.033.21±0.030.49±0.036.34±0.1033.83±0.017.69±0.0150.69±0.017.79±0.01ZS8-337.82±0.122.75±0.053.70±0.030.20±0.0214.47±0.1254.05±0.3719.00±0.1525.54±0.031.41±0.02ZS8-343.57±0.042.87±0.023.89±0.040.16±0.0110.48±0.0934.03±0.2227.40±0.1137.08±0.031.49±0.02ZS8-352.86±0.022.80±0.012.44±0.020.52±0.028.62±0.0433.15±0.0332.44±0.0128.33±0.046.08±0.05ZS8-365.16±0.123.15±0.036.60±0.080.40±0.0615.30±0.1433.69±0.2320.57±0.0743.12±0.122.61±0.07ZS8-373.13±0.071.98±0.012.32±0.030.06±0.017.49±0.0541.81±0.1426.49±0.0430.93±0.070.77±0.01ZS8-386.75±0.050.99±0.015.34±0.040.20±0.0213.28±0.1250.86±0.127.43±0.0540.18±0.111.52±0.03ZS8-395.18±0.084.27±0.022.72±0.020.17±0.0312.35±0.2141.97±0.2534.59±0.0622.05±0.051.39±0.10ZS8-409.62±0.100.89±0.044.09±0.100.24±0.0114.84±0.2364.82±0.355.97±0.1327.57±0.271.64±0.08ZS8-410.65±0.016.45±0.086.37±0.070.63±0.0214.10±0.184.58±0.0945.71±0.1445.21±0.174.49±0.10ZS8-429.59±0.041.54±0.064.41±0.020.65±0.0216.20±0.2059.21±0.129.53±0.0827.25±0.104.01±0.08ZS8-435.75±0.042.02±0.018.05±0.050.73±0.0316.56±0.1034.74±0.1012.23±0.0648.61±0.094.41±0.05ZS8-441.29±0.021.27±0.014.62±0.010.22±0.017.40±0.0817.42±0.0317.21±0.0162.39±0.122.99±0.03ZS8-453.72±0.011.27±0.017.53±0.080.78±0.0513.30±0.1427.99±0.039.57±0.0156.59±0.125.84±0.10ZS8-464.16±0.051.27±0.029.18±0.120.36±0.0314.97±0.2027.80±0.108.51±0.0661.32±0.232.38±0.01ZS8-474.04±0.032.69±0.037.50±0.050.50±0.0114.74±0.1527.44±0.0918.28±0.1050.91±0.213.37±0.01ZS8-488.86±0.121.43±0.013.59±0.071.00±0.0114.88±0.1659.59±0.369.58±0.0424.13±0.136.70±0.03ZS8-496.72±0.092.34±0.025.30±0.020.55±0.0114.90±0.1145.08±0.2715.71±0.0835.55±0.063.66±0.02

1)ZS8： ‘中山8號’‘Zhongshan No. 8’； ZS8-1-ZS8-103： ‘中山8號’自交S1代植株 Self-crossing S1progeny plants of ‘Zhongshan No. 8’. RA： 萊鮑迪苷A Rebaudioside A； ST： 甜菊苷 Stevioside； RC： 萊鮑迪苷C Rebaudioside C； DA： 杜爾可苷A Dulcoside A； TSG： 總甜菊糖苷 Total steviol glycosides.

3 討論和結(jié)論

3.1 甜菊的自交不親和特性

作者在長期的甜菊育種研究中觀察發(fā)現(xiàn)：部分自交結(jié)實率為0.0%的甜菊品種在自花授粉后可以形成幼胚，但在隨后的發(fā)育過程中不同程度地敗育。本研究甜菊6個品種自交授粉后不同天數(shù)的有胚率差異顯著，其中，自交授粉后5 d甜菊品種‘中山8號’的有胚率高達(dá)16.0%，自交授粉后10 d降至2.0%，由此可見，甜菊的自交不親和性除了受精前障礙外還存在受精后障礙。

3.2 甜菊的胚挽救方法

植物育種中通過離體培養(yǎng)進(jìn)行胚挽救，使可能敗育或退化的胚經(jīng)過適宜的離體培養(yǎng)獲得再生植株[16]。由于不同植物胚的自身條件各不相同，而且影響胚生長發(fā)育的因子十分復(fù)雜，不同植物胚挽救體系存在較大差別。影響胚挽救的主要因子包括基因型、胚的發(fā)育時期、培養(yǎng)基、激素以及培養(yǎng)條件[16-17]。本研究中，自交授粉后5 d，‘中山8號’和‘中山5號’的有胚率較高，分別為16.0%和12.1%，自交授粉后10 d，二者的有胚率分別僅2.0%和1.0%；自交授粉后5 d，‘江甜2號’、‘譜星1號’和‘守田3號’的有胚率分別為8.0%、6.0%和2.8%，自交授粉后10 d，三者的有胚率均降為0.0%；而‘中山6號’自交有胚率始終為0.0%。說明基因型是胚挽救技術(shù)在甜菊自交育種應(yīng)用中的主要限制因子。

一般認(rèn)為胚的發(fā)育時期是影響胚培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因子之一，因此，確定最佳的胚離體培養(yǎng)時期對胚挽救至關(guān)重要。朱際君等[18]認(rèn)為，胚齡越小，越難培養(yǎng)成功，原因為取材過早，合子胚完全為異養(yǎng)，離體培養(yǎng)所需的營養(yǎng)及條件要求復(fù)雜，很難培養(yǎng)成功；但取材過晚，又由于母體內(nèi)不協(xié)調(diào)性的激化而導(dǎo)致胚生活力降低。胚由異養(yǎng)轉(zhuǎn)為自養(yǎng)是胚發(fā)育的關(guān)鍵時期，通常心形胚發(fā)育中期之前是異養(yǎng)，心形胚晚期轉(zhuǎn)為自養(yǎng)。甜菊傳粉后約6 h雌性和雄性核融合，傳粉后約8 h初生胚乳核分裂，傳粉后約10 h合子第1次分裂；心形胚階段，胚乳細(xì)胞呈現(xiàn)被消化吸收的跡象，胚發(fā)育早期其營養(yǎng)物質(zhì)主要來自珠被絨氈層，心形胚以后，其營養(yǎng)物質(zhì)主要依賴于胚乳細(xì)胞的解體[19]。本研究對‘中山8號’自交授粉后1和3 d的胚珠以及自交授粉后5、7和9 d的幼胚進(jìn)行了培養(yǎng)，結(jié)果隨自交授粉后天數(shù)的增加，胚珠和幼胚的萌發(fā)時間逐漸縮短，萌發(fā)率逐漸升高，其中授粉后1～3 d的胚珠培養(yǎng)難度較大可能是因為此時甜菊胚異養(yǎng)程度較高，離體培養(yǎng)難以滿足所需營養(yǎng)和條件；而授粉后10 d，幼胚發(fā)生不同程度的敗育，因此，自交授粉后7～9 d取材較為適宜。

適宜的培養(yǎng)基和激素是離體培養(yǎng)中促成胚發(fā)育成熟的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。本研究中，自交授粉后7～9 d‘中山8號’幼胚在MS培養(yǎng)基和愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加2.0 mg·mL-16-BA和2.0 mg·mL-1NAA的MS培養(yǎng)基)中幼胚的萌發(fā)率均較高，可能是因為所取幼胚處于發(fā)育后期，自養(yǎng)程度較高，在營養(yǎng)需求上較獨立，對外源營養(yǎng)要求簡單。由于MS培養(yǎng)基上的幼胚萌發(fā)類似種子萌發(fā)，幼苗健壯移栽易成活；而在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基(添加2.0 mg·mL-16-BA和0.2 mg·mL-1NAA的MS培養(yǎng)基)上幼胚容易被誘導(dǎo)形成愈傷組織，需要進(jìn)一步誘導(dǎo)再生，增加了胚挽救的工作量和難度，因此，MS培養(yǎng)基適宜于授粉后7～9 d甜菊幼胚的培養(yǎng)，而對于自交授粉后1～3 d的胚珠和自交授粉后5 d的幼胚可能還需調(diào)整培養(yǎng)基和激素以滿足其發(fā)育所需營養(yǎng)和條件。

3.3 甜菊胚挽救自交S1代植株的性狀分離

甜菊干葉為甜菊糖苷的提取原料，甜菊糖苷含量是其主要考察性狀。甜菊葉片中甜菊糖苷含量隨甜菊的生長發(fā)育波動，現(xiàn)蕾期其甜菊糖苷含量最高[20-22]，因此，現(xiàn)蕾期是甜菊的最佳收獲期，也是重要的農(nóng)藝性狀之一。本研究中，短日照處理下‘中山8號’自交S1代植株間現(xiàn)蕾期的差異較大，最早和最晚的現(xiàn)蕾期相差36 d；‘中山8號’103個自交S1代植株現(xiàn)蕾期葉片中萊鮑迪苷A、甜菊苷、萊鮑迪苷C、杜爾可苷A和總甜菊糖苷的含量及各甜菊糖苷含量占總甜菊糖苷含量比例的變化范圍均較大，說明‘中山8號’自交S1代發(fā)生了明顯的性狀分離。

3.4 甜菊自交胚挽救的重要意義

由于甜菊具有自交不親和性，異花授粉會導(dǎo)致其有性繁殖個體遺傳基礎(chǔ)差異大，雜合度高，不利于遺傳分析，因此，亟需建立甜菊自交群體。胚挽救技術(shù)可克服甜菊自交不親和受精后障礙，提高了獲得甜菊自交后代的效率。本研究通過胚挽救成功獲得‘中山8號’103個S1代植株，克服了自交不親和受精后障礙，提高了獲得自交后代的效率，因此，建議采取本方法進(jìn)行多代自交，最終建立自交系，以期為探索甜菊的基因分離、連鎖以及遺傳多樣性等提供實驗材料。