黎 桑 王光斌 李政文 曾 偉 饒妮妮,3*

1(電子科技大學(xué)信息生物中心，成都 611731)2(電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610054)3(電子科技大學(xué)廣東電子信息工程研究院，廣東 東莞 523808)

引言

心血管疾病一直都是威脅全人類健康的復(fù)雜疾病，而心肌病在心血管疾病的發(fā)病中占據(jù)了重要的位置，并且有著逐年上升的趨勢(shì)。其中，原發(fā)性心肌病的病因尚未明確，筆者所研究的DCM和RCM都屬于原發(fā)性心肌病[1]。

DCM的發(fā)病率占心肌病的80%以上，并且其中有58.3%死于該病[2]。因此，識(shí)別DCM的生物標(biāo)志物、探究DCM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及篩選DCM的治療靶點(diǎn)等問(wèn)題都十分重要。迄今為止，已找出超過(guò)40個(gè)與DCM致病相關(guān)的基因，如表1所示[3]。但是，這些基因?qū)τ诶斫釪CM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

表1 與DCM致病相關(guān)的基因[3]Tab.1 Genes associated with DCM disease[3]

RCM雖然發(fā)病率不高，僅占心肌病發(fā)病率的4.5%，但是它卻是最為嚴(yán)重的心肌病，其預(yù)后性較差，并且在臨床上常常容易被誤診。相關(guān)文獻(xiàn)[4]報(bào)道，RCM可能被誤診為DCM、病毒性心肌炎等。在DCM和晚期肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy，HCM)中，也會(huì)有在RCM中出現(xiàn)的舒張功能障礙的情況?？梢?jiàn)，RCM的精準(zhǔn)診斷一直是臨床上存在的一大難題。因此，通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選出RCM的生物標(biāo)志物，將能夠在一定程度上改善這一問(wèn)題。通過(guò)構(gòu)建RCM相關(guān)的差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，可以加深對(duì)RCM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制的理解。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于RCM致病基因的文獻(xiàn)報(bào)道較少，但TNNI3[5]、TNNT2[6]、ACTC[6]、MYH7[7]、DES[8]、TPM1[9]、MYL3[9]、MYL2[9]等都被證明與RCM相關(guān)。

為此，本研究首先識(shí)別兩類心肌病相關(guān)的差異表達(dá)基因；接著，通過(guò)構(gòu)建差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，分別篩選與兩類心肌病相關(guān)的基因標(biāo)志物，并對(duì)其功能進(jìn)行分析。在此基礎(chǔ)上，對(duì)兩類心肌病進(jìn)行比較，希望在分子層面上加以區(qū)分，減少誤診的幾率，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 RNA-Seq數(shù)據(jù)

本研究數(shù)據(jù)來(lái)自于EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI上編號(hào)為GEO-GSE71613)，是全基因高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)的數(shù)據(jù)，為Fastq格式。在DCM或RCM患者做心臟器官移植手術(shù)時(shí)，取出病變組織并進(jìn)行活體檢查，收集RNA樣本，通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到該數(shù)據(jù)；共有8組樣本，其中4個(gè)正常樣本(有8個(gè)Fastq文件)、2個(gè)DCM樣本和2個(gè)RCM樣本。數(shù)據(jù)下載網(wǎng)址為http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-71613/。

1.2 DCM/RCM相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選

采用標(biāo)準(zhǔn)化的RNA-Seq數(shù)據(jù)處理方法來(lái)篩選DCM/RCM相關(guān)的差異表達(dá)基因，包括質(zhì)量控制(FastQC)、參考序列比對(duì)(Tophat)、計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換(HTSeq)、歸一化(EDASeq)和差異表達(dá)(DESeq)等步驟。

本研究采用了FastQC進(jìn)行質(zhì)量控制，去除一些重復(fù)和低質(zhì)量的reads。在參考序列比對(duì)中，基因參考序列是hg38(UCSC數(shù)據(jù)庫(kù))。在Linux系統(tǒng)下運(yùn)行tophat調(diào)用bowtie2，就能完成參考序列比對(duì)，得到格式為SAM或者BAM的文件。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換由以下兩步完成：先將Map后的BAM文件通過(guò)Samtools軟件[10]轉(zhuǎn)化成排序過(guò)的SAM文件，再將排序過(guò)的SAM文件經(jīng)過(guò)HTSeq軟件[11]進(jìn)行定量分析得到計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)。歸一化是用來(lái)降低因測(cè)序的深度不同所產(chǎn)生的影響，以及潛在的其他重復(fù)性實(shí)驗(yàn)所帶來(lái)的影響，采用了R語(yǔ)言的軟件包EDASeq[12]來(lái)完成。最后，采用DESeq2軟件包進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。在眾多的差異表達(dá)分析方法中，DESeq2最適合于樣本數(shù)較少的數(shù)據(jù)[13]。因此，本研究選用DESeq2。

1.3 差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法及生物屬性分析

基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是利用R語(yǔ)言軟件包WGCNA實(shí)現(xiàn)的，其中選取皮爾遜相關(guān)系數(shù)作為基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的參考相關(guān)系數(shù)。假設(shè)兩個(gè)基因的表達(dá)譜變量分別為X和Y，這兩者之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)的計(jì)算公式如下：

(1)

式中：E表示求數(shù)學(xué)期望；cov表示求協(xié)方差；ρX,Y為相關(guān)系數(shù)，其值在(-1,1)之間。

用Matlab和R語(yǔ)言的WGCNA軟件包提取共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系對(duì)，將所得的關(guān)系對(duì)輸入軟件Pajek中，繪制出差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖。

進(jìn)一步，需要驗(yàn)證差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)屬于生物網(wǎng)絡(luò)，才能進(jìn)行后續(xù)的生物功能分析。生物網(wǎng)路應(yīng)該具備3個(gè)屬性：一是小世界的特性。構(gòu)建與差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)同規(guī)模和平均度數(shù)相同的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)，如果其特征路長(zhǎng)L1和聚集系數(shù)C1與差異表達(dá)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的兩個(gè)對(duì)應(yīng)參數(shù)L和C相比，滿足L≥L1并且C?C1，則所構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)具備小世界的特性[15]。二是無(wú)尺度分布的特性。三是生物網(wǎng)絡(luò)具有一定的魯棒性和適應(yīng)性。如果網(wǎng)絡(luò)的度分布符合冪率分布，則具有第二、三兩種屬性。

1.4 基于差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)識(shí)別疾病相關(guān)重要基因

重要節(jié)點(diǎn)在很大程度上涵蓋了網(wǎng)絡(luò)的重要信息，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[16]，取度排序(由大到小)前5%的差異表達(dá)基因作為網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)(即重要基因)。

2 結(jié)果

2.1 DCM和RCM相關(guān)的差異表達(dá)基因

對(duì)于DCM，篩選出451個(gè)差異表達(dá)基因，其中有上調(diào)基因218個(gè)、下調(diào)基因233個(gè)；對(duì)于RCM，篩選出1 326個(gè)差異表達(dá)基因，其中有上調(diào)基因594個(gè)、下調(diào)基因732個(gè)。

2.2 構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及生物屬性分析

2.2.1DCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及生物屬性

根據(jù)本文第1.3節(jié)中所介紹的皮爾遜相關(guān)網(wǎng)絡(luò)的硬閾值的選取條件[14]，取硬閾值為0.98，得到用DCM相關(guān)差異表達(dá)基因構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，其中網(wǎng)絡(luò)的特征參數(shù)為L(zhǎng)DCM=6.737 13，CDCM=0.590 259 02；隨后，構(gòu)建了與DCM的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)同規(guī)模及平均度數(shù)相同的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)，其特征路長(zhǎng)和聚集系數(shù)分別為L(zhǎng)1=2.924 35和C1=0.020 325 89，滿足LDCM≥L1和CDCM?C1。因此，所構(gòu)建的DCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)具備小世界的特性。DCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的度分布如圖1所示，符合冪律分布，因此所構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)具有一定的魯棒性和適應(yīng)性。由此可知，用DCM相關(guān)差異表達(dá)基因構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)屬于生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)。

圖1 DCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的度分布。(a)DCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的度的大小分布；(b)DCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的度的概率分布Fig.1 Degree distribution of DCM co-expression network. (a) Degree number of each node in DCM co-expression network; (b) Probability distribution of degree of each node in DCM co-expression network

2.2.2RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及生物屬性

同理，取硬閾值為0.98，得到用RCM相關(guān)差異表達(dá)基因構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，其中網(wǎng)絡(luò)的特征參數(shù)為L(zhǎng)RCM=6.737 13，CRCM=0.590 259 02；同理，構(gòu)造了與RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)同規(guī)模及平均度數(shù)相同的隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)，得到隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的特征路長(zhǎng)L2和聚集系數(shù)C2為L(zhǎng)2=2.743 34，C2=0.015 283 91，滿足LRCM≥L2和CRCM?C2。因此，RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)具備小世界的特性。RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的度分布如圖2所示，符合冪律分布，該網(wǎng)絡(luò)具有無(wú)尺度分布特性和一定的魯棒性及適應(yīng)性。 由此可知，用RCM相關(guān)差異表達(dá)基因構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)屬于生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)。

圖2 RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的度分布。(a)RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的度的大小分布；(b)RCM共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的度的概率分布Fig.2 Degree distribution of RCM co-expression network. (a) Degree number of each node in RCM co-expression network; (b) Probability distribution of degree of each node in RCM co-expression network

2.3 識(shí)別的DCM/RCM相關(guān)重要基因

2.3.1DCM的重要節(jié)點(diǎn)基因

篩選了與DCM相關(guān)的21個(gè)重要基因(基因標(biāo)志物)，如表2所示。其中，5個(gè)基因有文獻(xiàn)支持，與DCM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，分別為NRG1[17-19]、MAB21L2[20-21]、POSTN[22]、IGFBP3[23]和NPR3[24]。由此可知，本研究的部分預(yù)測(cè)結(jié)果得到了現(xiàn)有生物證據(jù)的支持，提示這些預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

表2DCM相關(guān)的21個(gè)重要基因及其生物功能

Tab.221DCM-relatedkeygenesandtheirbiologicalfunctions

序號(hào)GENE NAME基因所對(duì)應(yīng)的生物功能1SYT12調(diào)解鈣離子所依賴的突觸傳遞運(yùn)輸?shù)哪?COMP 編碼細(xì)胞外基質(zhì)的非膠原蛋白;鈣離子結(jié)合和蛋白質(zhì)綁定3FOSB調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和轉(zhuǎn)換4NRG1 編碼出膜糖蛋白,能夠介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo);在器官系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育中起作用5ART4 NAD(P)+蛋白精氨酸ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性;與蛋白質(zhì)代謝通路相關(guān)6MAB21L2 TGF—β信號(hào)通路(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子信號(hào)通路)的下游靶向7FBXL16 與免疫系統(tǒng)通路、 I類MHC介導(dǎo)的抗原加工和表達(dá)通路相關(guān)8PLXDC2受體活性相關(guān)9SMYD2與基因表達(dá)與染色質(zhì)構(gòu)型通路相關(guān)10SNAP25 基因產(chǎn)物是突觸前等離子體膜蛋白,參與神經(jīng)遞質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)11CP 編碼結(jié)合大部分銅等離子體的金屬蛋白,參與鐵(II)轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵(III)轉(zhuǎn)鐵蛋白的過(guò)氧化反應(yīng)12COL8A1 基因產(chǎn)物是一個(gè)短鏈膠原蛋白和角膜內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜的主要組成部分13IGFN1蛋白編碼基因14NPR3 編碼3個(gè)利鈉肽受體之一;利鈉肽受體是一種調(diào)節(jié)血容量和壓力、肺動(dòng)脈高壓、心臟功能以及一些代謝和生長(zhǎng)過(guò)程的小肽15POSTN 編碼分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,具有組織發(fā)展和再生的功能,包括傷口愈合和心肌梗死后心室重塑16DIRAS3生長(zhǎng)抑制相關(guān);腫瘤抑制功能17IGFBP3 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白,促進(jìn)細(xì)胞的分化、增殖以及個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育18RGS1 通過(guò)綁定激活減弱G的蛋白質(zhì)信號(hào)活動(dòng),提高從 GTP轉(zhuǎn)化到 GDP的速率19B2M與分解代謝過(guò)度的低蛋白血癥相關(guān)20BMX 編碼蛋白與Stat通路、調(diào)節(jié)的幾種類型癌細(xì)胞的分化和致瘤性的通路相關(guān)21OMD與新陳代謝、艾滋病毒生命周期通路相關(guān)

2.3.2RCM的重要節(jié)點(diǎn)基因

篩選了與RCM相關(guān)的65個(gè)重要基因(基因標(biāo)志物)，如表3所示。其中，2個(gè)基因有文獻(xiàn)支持，與RCM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，分別為T(mén)NNI3[5]和DES[8]。由此可知，本研究的部分預(yù)測(cè)結(jié)果得到了現(xiàn)有生物證據(jù)的支持，提示這些預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

表3RCM相關(guān)的65個(gè)重要節(jié)點(diǎn)基因及其生物功能

Tab.365RCM-relatedkeygenesandtheirbiologicalfunctions

序號(hào)GENE NAME基因所對(duì)應(yīng)的生物功能1PON2 編碼蛋白在人體組織、膜結(jié)合中廣泛表達(dá),可以作為細(xì)胞抗氧化劑,保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激;該基因缺失與血管類疾病、糖尿病等變型疾病相關(guān)2FN3KRP 轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性相關(guān),蛋白質(zhì)代謝、γ羧化作用等通路相關(guān)3TRAK2 受體結(jié)合和GABA受體結(jié)合相關(guān);與新陳代謝通路相關(guān)4KMT2A 與轉(zhuǎn)錄因子活性、特異的DNA序列結(jié)合、同類蛋白結(jié)合相關(guān)5F2R 屬于G蛋白耦合的受體家族,是凝血因子II受體,能調(diào)節(jié)血栓性反應(yīng)6ARHGAP33磷酸肌醇綁定的功能位點(diǎn),與胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)7LRRN3蛋白質(zhì)復(fù)雜的綁定相關(guān)8FIBIN蛋白編碼基因9TNNI3 在心肌組織表達(dá),該基因突變會(huì)導(dǎo)致家族性的RCM10CELF2 調(diào)控pre-mRNA可變的剪接,可能與信使RNA編校和翻譯相關(guān)11SHPK磷酸轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)12CREB3L1 轉(zhuǎn)錄因子活性,特異的DNA序列結(jié)合,染色質(zhì)綁定13SPECC1 位于細(xì)胞核,在睪丸和一些癌癥細(xì)胞系中高表達(dá)14ANKZF1蛋白編碼基因15EPHX2編碼蛋白位于胞質(zhì)和過(guò)氧化物酶體 16PTCH1 腫瘤抑制基因,基因的突變與基底細(xì)胞痣綜合癥、食管鱗狀細(xì)胞癌、毛上皮瘤、膀胱移行細(xì)胞癌以及前腦無(wú)裂畸形相關(guān)17ADK 催化ATP到腺苷的轉(zhuǎn)移,腺苷對(duì)心血管有很大的影響18ZNF599核酸綁定有關(guān);與基因的表達(dá)通路相關(guān)19UBN2轉(zhuǎn)錄因子活性、特異的DNA序列結(jié)合20ADAMTS17促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活21UBXN7轉(zhuǎn)錄因子綁定和泛素綁定22GAB1 分支管腺增生介質(zhì);在細(xì)胞的生長(zhǎng)反應(yīng)、運(yùn)輸和凋亡中起重要作用23TRIB2 與Wnt / Hedgehog / Notch、DNA損傷等通路相關(guān)24EI24 抑制細(xì)胞生長(zhǎng),通過(guò)細(xì)胞凋亡蛋白酶9和線粒體通路來(lái)誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞死亡25PATZ1 染色質(zhì)建模和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān),與雄激素受體信號(hào)通路、雄激素受體的活性通路相關(guān)26CKM 轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性,與新陳代謝等通路相關(guān)27DES 肌間線蛋白基因,與同類蛋白結(jié)合、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)組成相關(guān) 28CYS1細(xì)胞器生物起源和保持的信號(hào)通路有關(guān)29PDGFD 與生長(zhǎng)因子活性、血小板源生長(zhǎng)因子受體結(jié)合相關(guān)30XAF1與干擾素γ信號(hào)通路、免疫系統(tǒng)通路相關(guān)31AKAP6 離子通道綁定和綁定蛋白激酶相關(guān),與依賴cAMP的蛋白激酶激活、DAG/IP3信號(hào)通路相關(guān)

續(xù)表

3 討論

3.1 基于生物信息學(xué)工具的DCM相關(guān)基因標(biāo)志物的功能分析

3.1.1DCM相關(guān)基因標(biāo)志物的GO分析

將DCM相關(guān)的21個(gè)重要節(jié)點(diǎn)基因用GO分析的系統(tǒng)工具PANTHER進(jìn)行富集分析，得出以下結(jié)果：在生物學(xué)過(guò)程中，重要節(jié)點(diǎn)基因主要富集在細(xì)胞生理(54.5%)、代謝(31.8%)、多細(xì)胞生物(31.8%)、組織或生物起源細(xì)胞組件(27.3%)等過(guò)程中；在分子功能中，主要富集在蛋白結(jié)合(40.0%)、催化活性(27.3%)等方面；在細(xì)胞組成成分上，主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM,占27.3%)、膜(18.2%)、細(xì)胞組分(18.2%)等成分上。

3.1.2DCM相關(guān)基因標(biāo)志物的信號(hào)通路分析

同樣，由PANTHER可得出DCM相關(guān)的信號(hào)通路分析結(jié)果，包括整合素信號(hào)通路、p53通路、5-HT受體信號(hào)通路、β腎上腺素能受體信號(hào)通路、G蛋白的受體激活通路等。

Xiong等學(xué)者通過(guò)將大鼠的MDM4基因剔除，發(fā)現(xiàn)它最終發(fā)展成DCM，平均存活了153天；并且發(fā)現(xiàn)大鼠的MDM4基因突變是通過(guò)p53信號(hào)通路導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡，因此推測(cè)出p53通路可能在DCM的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用，也提示p53通路可能與DCM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制相關(guān)[25]。如圖3所示，p53基因在細(xì)胞生長(zhǎng)周期中起著負(fù)調(diào)節(jié)的作用，會(huì)間接促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。p53蛋白激活其靶基因IGFBP3(該基因是本研究所篩選出的DCM的基因標(biāo)志物)，IGFBP3會(huì)抑制IGF(胰島素樣生長(zhǎng)因子)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。p53蛋白激活其靶基因IGFBP3，而IGFBP3間接作用于IGF-1/mTOR通路。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Zhang等學(xué)者將小鼠的心臟進(jìn)行特異性的mTOR敲除，之后可導(dǎo)致小鼠發(fā)生致死性DCM[26]。因此，可推測(cè)出p53/IGF-1/mTOR通路可能與DCM的致病相關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚未明確。由此可知，本研究的部分預(yù)測(cè)結(jié)果得到了現(xiàn)有生物證據(jù)的支持，提示這些預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。

圖3 p53通路與DCM的關(guān)系(其中，黑色箭頭實(shí)線表示直接作用，黑色箭頭虛線表示間接作用，黑色直線加上小短線代表抑制作用，藍(lán)色箭頭虛線代表可能導(dǎo)致DCM)Fig.3 Relationship between p53 pathway and DCM (The black solid line with arrow represents direct regulation, the black dotted line with arrow indicates indirect regulation, the black solid line with short line represents inhibition and the blue dotted line with arrow indicates that DCM were possibly induced)

3.2 基于生物信息學(xué)工具的RCM相關(guān)基因標(biāo)志物的功能分析

3.2.1RCM相關(guān)基因標(biāo)志物的GO分析

RCM的65個(gè)基因標(biāo)志物用系統(tǒng)工具PANTHER進(jìn)行GO功能富集分析，得出如下結(jié)果：在生物學(xué)過(guò)程中，主要富集在細(xì)胞生理(38.5%)、代謝(36.9%)、應(yīng)激(12.3%)等過(guò)程中；在分子功能中，主要富集在催化活性(32.3%)、蛋白結(jié)合(23.1%)等方面；在細(xì)胞組成成分上，主要富集在細(xì)胞組分(18.5%)、細(xì)胞的細(xì)胞器(13.8%)、細(xì)胞外基質(zhì)(7.7%)等成分上。

3.2.2RCM相關(guān)基因標(biāo)志物的信號(hào)通路分析

同樣，由PANTHER可得出DCM相關(guān)的信號(hào)通路的結(jié)果，包括Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、EGF受體信號(hào)通路、血管生成通路、血液凝固通路等路徑。

RCM的基因標(biāo)志物FRZB和FBXW11參與了Wnt信號(hào)通路，而Wnt信號(hào)通路在心臟的發(fā)育以及心肌細(xì)胞的分化過(guò)程中起著非常重要的作用。Cohen等學(xué)者通過(guò)生物實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠的胚胎進(jìn)行Wnt5a和Wnt11的同時(shí)敲除，導(dǎo)致了經(jīng)典Wnt信號(hào)的激活，最終造成心臟發(fā)育缺陷[27]。越來(lái)越多證據(jù)表明，Wnt信號(hào)通路參與了心臟重構(gòu)和心衰的進(jìn)程[28]，雖然RCM的致病通路在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中很少涉及，但是研究發(fā)現(xiàn)RCM的基因標(biāo)志物能關(guān)聯(lián)到此通路。因此猜測(cè)，在RCM的病程中，RCM很容易發(fā)展為心衰(與RCM預(yù)后性差符合)，并且可能與Wnt通路相關(guān)。

RCM的基因標(biāo)志物NOTCH4介導(dǎo)了Notch信號(hào)通路。NOTCH4編碼Notch蛋白，間接作用于MAPK信號(hào)通路。在所發(fā)現(xiàn)的MAPK信號(hào)通路中，JNK MAPK和p38 MAPK信號(hào)通路在應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等。文獻(xiàn)[29]表明，p38 MAPK信號(hào)通路在RCM中有著重要的作用。除此之外，在心臟發(fā)育中，Notch信號(hào)通路也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，參與了心肌的分化過(guò)程，并且在血管的損傷修復(fù)中起著重要的作用。

3.3 DCM與RCM的比較

3.3.1DCM與RCM的基因標(biāo)志物比較

DCM與RCM只有一個(gè)相同的基因標(biāo)志物——NPR3，該基因已被證實(shí)可以保護(hù)心肌細(xì)胞[24]。

3.3.2GO分析結(jié)果的比較

DCM和RCM有著相同的GO功能富集分析條目。在生物學(xué)過(guò)程中，兩者都主要與細(xì)胞生理和代謝過(guò)程相關(guān)；在分子功能方面，兩者都具有蛋白結(jié)合和催化活性兩類功能；在細(xì)胞組成成分上，兩者都富集在細(xì)胞組分和細(xì)胞外基質(zhì)上。

然而，DCM與/RCM也有著不相同的GO功能富集分析條目。在生物學(xué)過(guò)程中，DCM基因標(biāo)志物富集在多細(xì)胞生物、組織或生物起源細(xì)胞組件等過(guò)程中，而心肌細(xì)胞凋亡與DCM的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，這與其基因標(biāo)志物富集在多細(xì)胞生物等過(guò)程相符；RCM的基因標(biāo)志物則還富集在應(yīng)激過(guò)程中，說(shuō)明RCM的發(fā)生發(fā)展可能與應(yīng)激性相關(guān)。在細(xì)胞的組成成分上，DCM的基因標(biāo)志物富集在膜成分上，而RCM的基因標(biāo)志物則富集在細(xì)胞的細(xì)胞器上?；驑?biāo)志物在細(xì)胞中位置的分布，在一定程度上反映了其調(diào)控蛋白的功能。

有學(xué)者對(duì)細(xì)胞中的鈉鉀鈣鎂離子及ATP與正常人細(xì)胞中的含量及其轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中離子的異常變化及其轉(zhuǎn)運(yùn)的障礙在DCM病程的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[30]，而細(xì)胞的膜正是與離子的轉(zhuǎn)運(yùn)直接相關(guān)聯(lián)的。這個(gè)證據(jù)間接地證明了上述分析的可靠度。

3.3.2信號(hào)通路分析結(jié)果的比較

DCM與RCM與相同的信號(hào)通路相關(guān)，分別為EGF受體信號(hào)通路和異三聚體G蛋白信號(hào)通路。但是，介導(dǎo)同一通路的基因標(biāo)志物卻是不同的，如DCM的基因標(biāo)志物NRG1和 RCM的基因標(biāo)志物GAB1分別介導(dǎo)EGF受體信號(hào)通路。

然而，兩類心肌疾病相關(guān)的生物信號(hào)通路也存在較大差異。DCM的基因標(biāo)志物參與P53通路、炎癥介導(dǎo)信號(hào)通路、β腎上腺素能受體信號(hào)通路以及G蛋白受體激活通路等，DCM病程的發(fā)生發(fā)展機(jī)制主要與炎癥通路、細(xì)胞凋亡以及Ca離子等密切相關(guān)。RCM的基因標(biāo)志物參與Wnt信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等，這些通路都與心衰有著非常密切的關(guān)系。由此推測(cè)，RCM的預(yù)后性差可能與基因標(biāo)志物介導(dǎo)這些通路相關(guān)，使得RCM更容易向心衰發(fā)展。

3.4 本研究的局限與進(jìn)一步的工作

在本研究中，分別識(shí)別出了DCM和RCM相關(guān)的基因標(biāo)志物，且部分基因標(biāo)志物有文獻(xiàn)支持，如DCM致病相關(guān)基因MAB21L2和POSTN、RCM致病相關(guān)基因TNNI3和DES。雖然現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)和生物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上述基因在疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起到了重要作用，但是其作為靶標(biāo)的特異性并未得到證實(shí)。因此，下一步的工作需要對(duì)這些可能的基因標(biāo)志物進(jìn)行特異性的驗(yàn)證，以找到這兩類心肌疾病的治療靶點(diǎn)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)了與兩類心肌疾病相關(guān)的一些新的基因，如在DCM中找出的SNAP25、COL8A1、B2M等基因，在RCM中找出的TSC1、FBXW11、NOTCH4等基因。雖然這些新發(fā)現(xiàn)的基因與疾病的直接關(guān)系在生物實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)有的文獻(xiàn)中并未得到證實(shí)，但是GO和KEGG的分析表明，這些基因都與心血管疾病相關(guān)，其所介導(dǎo)的通路也與這兩類心肌疾病息息相關(guān)，因而具有作為兩類心肌疾病標(biāo)志物的潛力，值得開(kāi)展進(jìn)一步的生物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證它們的功能。

最后，筆者對(duì)DCM和RCM的發(fā)生發(fā)展機(jī)制進(jìn)行了一些新的闡釋。由于現(xiàn)有的相關(guān)文獻(xiàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)太少，因此對(duì)于完全理解DCM和RCM復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制還存在較大距離，還有待后續(xù)的深入研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在分子水平上比較DCM和RCM兩類心肌疾病，發(fā)現(xiàn)兩者在生物標(biāo)記物及其分子功能、相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)路徑以及發(fā)生發(fā)展機(jī)制等方面存在較大差異。研究結(jié)果有助于在分子層面上區(qū)分DCM和RCM兩類心肌疾病，為減少兩者誤診的幾率以及精準(zhǔn)醫(yī)療提供重要參考。