張小莉 楊軍

摘要：目的 探討壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松大鼠血清骨鈣素（BGP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）以及血清超氧化物歧化酶（SOD）表達(dá)的影響。 方法 將實驗動物分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組、壯骨止痛方低劑量治療組、雌二醇組5組，用酶聯(lián)免疫免法測定大鼠血清中BGP、TRAP 、SOD的水平。結(jié)果 模型組大鼠血清OPg，SOD降低、TRAP水平升高，經(jīng)壯骨止痛方藥物干預(yù)后，大鼠血清OPg，SOD水平明顯下降、TRAP水平明顯下降。結(jié)論 壯骨止痛方藥物可以提升大鼠血清OPg，SOD的比值，降低TRAP的水平，達(dá)到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用。

關(guān)鍵詞：壯骨止痛方;骨鈣素;抗酒石酸酸性磷酸酶;超氧化物歧化酶

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）09-0071-03

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是以骨量減少，骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄等骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征的一種全身性骨病[1]。隨著人口老齡化的迅速到來，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴(yán)重的社會問題，其發(fā)病率已經(jīng)躍居世界各種常見病的第7位[2]。壯骨止痛方是湖南省名中醫(yī)莫新民教授研發(fā)而成，已經(jīng)獲得國家新藥證書（國藥證字Z20050125），對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好療效[3-6]。本研究以經(jīng)典的骨質(zhì)疏松動物模型，用壯骨止痛方藥物進(jìn)行干預(yù)治療，檢測大鼠血清中BGP，TRAP，SOD 含量變化，從而揭示壯骨止痛方預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實驗藥物 壯骨止痛方（補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞、黨參、白術(shù)、芍藥、骨碎補(bǔ)、丹參、甘草）藥物由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，動物灌胃前制備成混懸液，戊酸雌二醇（生產(chǎn)企業(yè)：拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，藥品批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20130009）

1.2 實驗動物 SD大鼠50只，SPF級，體重（ 200 ±20）g，雌鼠，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2012-0007。動物飼養(yǎng)于清潔級飼養(yǎng)室，期間自由飲水、攝食，室溫20-25℃，濕度40%-70%，光照周期12h/12h，通風(fēng)良好。

1.3 試劑與儀器 青霉素（華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020655）;大鼠骨鈣素（BGP）ELISA檢測試劑盒，大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）ELISA檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）ELISA檢測試劑盒均購自（E20160801A，蘇州爾卡文生物科技有限公司）。ELX808-IU酶標(biāo)儀（美國寶特）;BT-25S型電子天平（上海），0.5-10 l、2-20 l、1-200 l，200-1000 l移液槍。

2 方法

2.1 動物造模 參照文獻(xiàn)方法復(fù)制雌性大鼠去卵巢3個月的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型[7]，取同批次250 g左右的雌性SD大白鼠共40只，月齡10～12個月。按體重將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組（13.2 g/kg/d）、壯骨止痛方低劑量治療組（3.3 g/kg/d）、雌二醇組（0.167 mg/kg/d）共5組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余4組均切除雙側(cè)卵巢造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型。

2.2 給藥方法 假手術(shù)組和模型組每天灌胃以相應(yīng)體積冷開水，壯骨止痛方治療組、雌二醇組灌胃以相應(yīng)藥物，劑量按成人劑量及人鼠體表面積折算確定。各組均從第5天拆線后開始給藥，每天灌胃一次，連續(xù)12周。

2.2 標(biāo)本采集 給藥12周，最后一次灌胃后2 h，處死各組大鼠，從腹主動脈取血，分離血清后，再轉(zhuǎn)放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆么治觥?/p>

2.3 指標(biāo)檢測 指標(biāo)檢測前，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)項目的測定。主要測定大鼠血清BGP，TRAP，SOD 含量變化，方法為酶聯(lián)免疫分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS16.0軟件包分析，實驗設(shè)計為多因素非平衡的組合類型，將組別拆分成兩個組合進(jìn)行比較，即模型組與空白組進(jìn)行比較，模型組與觀察組、對照組進(jìn)行比較，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，先進(jìn)行正態(tài)分析，符合要求后各組間差異分別采用單因素方差分析和t檢驗，P值小于0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

結(jié)果如表1所示：（1）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BGP含量明顯下降（P<0.01），說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功;與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中BGP含量明顯升高（P<0.05），均有統(tǒng)計學(xué)差異。提示壯骨止痛方藥物對升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清BGP含量有較好作用。（2）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中SOD含量明顯下降（P<0.01），有顯著差異;與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組、低劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中SOD含量明顯升高（P<0.05），提示壯骨止痛方藥物對升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清SOD含量有較好作用。（3）與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TRAP含量明顯升高（P<0.01），有顯著差異;與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組大鼠血清中TRAP含量明顯下降（P<0.01），提示壯骨止痛方藥物對降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清TRAP含量有較好作用。

表1 各組大鼠血清中BGP、SOD及TRAP含量變化

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)學(xué)多屬“骨痿”、“骨痹”、“腰痛”等范疇，如《素問·痿論》“腎者水藏也，今水不勝火，則骨枯而髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿”，辨證主要是肝腎虧虛，壯骨止痛方由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞、黨參、白術(shù)、芍藥、骨碎補(bǔ)、丹參、甘草九味藥物組成，具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛之功，防治骨質(zhì)疏松癥，均取得良好療效。

骨鈣素（ Osteocalcin，OCN），也稱γ-羧基谷氨酸蛋白（ Bone γCarboxyglutamic Acid-Containing Protein，BGP）或 骨 依 賴 維 生 素K 蛋 白（ Bone V itamin K Dependent Protein），BGP 主要由骨和牙齒中的成骨細(xì)胞合成并分泌，是體內(nèi)最豐富的非膠原骨基質(zhì)蛋白，將其作為羥基磷灰石晶體儲存在骨礦物基質(zhì)中，它被認(rèn)定為骨形成標(biāo)志物是反映成骨細(xì)胞活性的特異而敏感的標(biāo)志物[8]，BGP 依種屬的不同由 47-50個氨基酸組成，其共同特點是 17、21、24 位有3個羧化的谷氨酸殘基以及 23、29 位形成一個分子內(nèi)二硫健，在 Ca2+存在條件下，羧化后 BGP16- 25 位氨基酸殘基形成一緊密的α螺旋結(jié)構(gòu)，這種構(gòu)象使 3 個谷氨酸殘基突向同一方向排列，促進(jìn)其與羥磷灰石結(jié)合[9]。

最新研究表明，骨為新型的內(nèi)分泌器官，具有內(nèi)分泌功能[10]，骨鈣素為其中之一，其主要的作用途徑是：成骨細(xì)胞產(chǎn)生的 OCN 以低羧化骨鈣素（undercarboxylated-osteocalcin，ucOCN）的形式釋放入血，通過血液循環(huán)達(dá)到多種組織器官調(diào)節(jié)能量代謝[11]，作用于胰島β細(xì)胞，促進(jìn)胰島素的產(chǎn)生和分泌，胰島素正反饋骨，促進(jìn)骨鈣素的活化，達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松的目的。

在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中BGP含量明顯下降（P<0.01），說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功;經(jīng)過壯骨止痛方藥物干預(yù)后，與模型組比較，尤其是壯骨止痛方高劑量組大鼠血清中BGP含量明顯升高，（P<0.05），統(tǒng)計學(xué)差異明顯。提示壯骨止痛方藥物可以提升絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清BGP含量，增加大鼠成骨細(xì)胞的活性，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。

抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）是酸性磷酸酶6種同工酶中的一種，即第 5 型，主要由破骨細(xì)胞釋放，骨吸收時TRAP 參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化物的降解，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于骨質(zhì)疏松的治療原則[12]，主要為抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成。因此，血清中的 TRAP可以反映體內(nèi)破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀態(tài)。TRAP 缺乏和過度表達(dá)的大鼠模型分別表現(xiàn)為骨硬化和骨質(zhì)疏松。

在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中TRAP含量明顯升高（P<0.01），說明骨質(zhì)疏松癥可以引起TRAP含量下降，經(jīng)過壯骨止痛方藥物干預(yù)后，與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組大鼠血清中TRAP含量明顯下降（P<0.01），提示壯骨止痛方可以降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清TRAP含量，抑制破骨細(xì)胞的生成，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。

氧化應(yīng)激是骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究中的熱點，其核心理論是：在衰老或者長期大劑量應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等刺激物時，機(jī)體中活性氧自由基（ROS），ROS在人體處于平衡狀態(tài)下的自由基濃度很低，不但不會對機(jī)體造成損傷，而且還具有信號調(diào)節(jié)、代謝、生存和凋亡等重要的生理功能，只有在在代謝過程中大量堆積，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出機(jī)體自身的清除能力，引發(fā)氧化應(yīng)激（OS），并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生衰老和凋亡，最后導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生與骨質(zhì)疏松等退行性疾病[13]，機(jī)體抗氧化酶防御系統(tǒng)中的SOD，能有效地清除過多的ROS，以保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷[14]。

在本實驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中SOD含量明顯下降（P<0.01）;經(jīng)過壯骨止痛方藥物干預(yù)后，與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組、低劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中SOD含量明顯升高（P<0.05），提示壯骨止痛方藥物可以提高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清SOD含量，可能通過體內(nèi)清除引發(fā)氧化應(yīng)激的物質(zhì)，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的療效。

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（收稿日期：2018-05-15）