王天寶，王 揚(yáng)，羅 磊，畢研貞，馬正來(lái)，呂 君，李德旭，朱 斌

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染疾病科二病區(qū)，河南 衛(wèi)輝 453100；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病中心，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院疑難肝病與人工肝中心，北京 100069；4.首都醫(yī)科大學(xué)肝病轉(zhuǎn)化研究所，北京 100069；5.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，河南 鄭州 450052；6.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰脾外一科二病區(qū)，河南 鄭州 450052)

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)流行地區(qū)，20%～40%的慢性乙型肝炎患者存在重疊感染戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是在亞洲、非洲、拉丁美洲經(jīng)濟(jì)不發(fā)達(dá)地區(qū)，HBV與HEV重疊感染可能導(dǎo)致慢加急性肝衰竭[1-5]，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡，需要及時(shí)治療干預(yù)[6-8]。CD4+T淋巴細(xì)胞參與HBV和急性HEV感染的發(fā)病過(guò)程[9-13]，但在HBV與HEV重疊感染患者中，T淋巴細(xì)胞數(shù)目變化特點(diǎn)及相關(guān)的臨床因素尚不清楚。本研究旨在探討HBV與HEV重疊感染患者的T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化及重疊感染相關(guān)的臨床危險(xiǎn)因素。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2001年8月至2012年7月新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的28例HEV感染患者及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院收治的58例HEV感染患者為觀察對(duì)象。86例患者中，男65例，女21例；年齡39～94(67.55±9.37)歲；患者均符合病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[14]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲；(2)患者均知情同意，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他原因造成的肝病或合并其他病毒感染，包括同時(shí)感染丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、人類(lèi)免疫缺陷病毒者，或存在自身免疫性肝??；(2)有其他重大疾病，如嚴(yán)重心臟病、腎臟疾病等；(3)有惡性腫瘤病史，包括原發(fā)性肝癌、原位癌和肝臟不典型增生結(jié)節(jié)；(4)有肝硬化病史或B型超聲、CT等影像學(xué)檢查提示肝硬化者；(5)入組前6個(gè)月接受皮質(zhì)類(lèi)固醇藥物、免疫抑制劑或化學(xué)治療藥物者。86例患者根據(jù)是否同時(shí)存在HBV感染分為HEV感染組和重疊感染組，其中HEV感染組74例，男57例，女 17例，年齡60～94(69.38±7.54)歲；重疊感染組12例，男8例，女4例，年齡39～75(56.25±11.81)歲。本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院及首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2血清學(xué)指標(biāo)實(shí)驗(yàn)室檢查

1.2.1標(biāo)本采集及處理所有患者于晨起空腹?fàn)顟B(tài)下采集肘前靜脈血約20 mL，分別保存于6個(gè)一次性真空采血管(英國(guó)Becton Dickinson and Company公司)，其中肝素抗凝管、枸櫞酸鈉凝血管和乙二胺四乙酸抗凝管各1個(gè)，惰性分離膠促凝管3個(gè)。室溫靜置約1 h，待其自行凝固，TDL80-2B常溫臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)2 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。肝素抗凝管血漿用于生物化學(xué)檢測(cè)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、空腹血糖(fasting blood-glucose，F(xiàn)BG)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(glutamyltransferase，γ-GGT)、白蛋白(albumin，ALB)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)和膽固醇(cholesterol，CHOL)；惰性分離膠促凝管血清用于甲胎蛋白(α-fetoprotein，AFP)、IgA、IgM、IgG、C3、C4以及甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)抗體、HBV相關(guān)抗原及抗體、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)抗體、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus，HDV)抗體、HEV抗體、巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)抗體、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)抗體和人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)抗體；枸櫞酸鈉凝血管血漿用于凝血酶原活動(dòng)度(prothrombin activity，PTA)檢測(cè)；乙二胺四乙酸抗凝管血漿用于T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)，包括CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.2.2血生物化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)肝功能血清標(biāo)志物的檢測(cè)中，ALT檢測(cè)采用國(guó)際臨床化學(xué)委員會(huì)推薦法為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的兩步法，AST檢測(cè)采用紫外-蘋(píng)果酸脫氫酶法，DBIL和TBIL檢測(cè)采用釩酸鹽氧化法，γ-GGT檢測(cè)采用L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺法，ALB檢測(cè)采用溴甲苯綠法，ALP檢測(cè)采用2-氨基-2甲基-1-丙醇法，TBA檢測(cè)采用循環(huán)酶法，F(xiàn)BG及CHOL檢測(cè)采用氧化酶法，檢測(cè)儀器為日本Olymous公司AU系列全自動(dòng)生物化學(xué)檢測(cè)儀，試劑盒均購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司。AFP檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光免疫法，儀器為瑞士羅氏Cobas e601型全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，試劑購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。PTA檢測(cè)采用凝固法，使用儀器為日本希森美康公司SysmexCA-7000凝血分析儀，試劑為配套試劑。所有操作流程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3血肝炎病毒學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)HBV標(biāo)志物，包括HBsAg、HbeAg和HBeAb，儀器為瑞士羅氏公司Cobas全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，試劑盒購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司。HBV DNA定量檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法，使用瑞士羅氏公司Cobas?AmpliPrep-TaqMan平臺(tái)，試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)其余肝炎病毒學(xué)標(biāo)志物，包括HAV、HCV、HDV、HEV、CMV、EBV和HIV抗體，檢測(cè)儀器為西班牙基立福公司變色龍triturus全自動(dòng)酶免分析儀，試劑盒購(gòu)自上?？迫A生物工程股份有限公司或北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司。所有操作流程按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4T淋巴細(xì)胞亞群及免疫5項(xiàng)檢測(cè)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群，包括CD3+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞，檢測(cè)儀器為美國(guó)BECTON DICKINSON公司的FACSCalibur流式細(xì)胞分析分選系統(tǒng)，三色單克隆抗體試劑(CD3 PerCP/CD4FITC/CD8 PE，BECTON DICKINSON公司)購(gòu)自美國(guó)BD公司。采用免疫比濁法檢測(cè)免疫5項(xiàng)，包括IgA、IgM、IgG、C3和C4，檢測(cè)儀器為德國(guó)西門(mén)子公司BNTMⅡ全自動(dòng)蛋白分析系統(tǒng)，使用西門(mén)子配套試劑，所有操作均按照廠家操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.12組患者一般臨床資料及血生物化學(xué)指標(biāo)結(jié)果比較結(jié)果見(jiàn)表1。重疊感染組患者的年齡、ALT和PTA均低于HEV感染組患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-3.588、-2.044，t′=-6.720，P<0.05)。2組患者性別構(gòu)成、住院時(shí)間及AST、TBIL、DBIL、γ-GGT、ALB、AFP、ALP、FBG和CHOL水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 2組患者一般臨床資料及血生物化學(xué)指標(biāo)比較

2.22組患者T淋巴細(xì)胞亞群及免疫5項(xiàng)結(jié)果比較結(jié)果見(jiàn)表2。重疊感染組患者CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于HEV感染組，CD4+T/CD8+T顯著高于HEV感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.175、-2.091，P<0.05)。2組患者CD3+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)及IgA、IgM、IgG、C3、C4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 2組患者T淋巴細(xì)胞亞群及免疫5項(xiàng)結(jié)果比較

2.3與HBV重疊感染HEV患者相關(guān)的多因素分析將年齡、ALT、PTA及CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)帶入多因素回歸分析，結(jié)果顯示(表3)，PTA與HBV重疊感染HEV有相關(guān)性(OR=1.056，95%可信區(qū)間為1.009～1.105，P<0.05)。

表3 與HBV重疊HEV感染患者相關(guān)的多因素分析

2.4年齡、ALT和PTA與T淋巴細(xì)胞亞群及免疫5項(xiàng)水平之間的相關(guān)性結(jié)果見(jiàn)表4。Spearman分析結(jié)果表明，PTA與C3水平呈正相關(guān)(r=0.37，P<0.05)，PTA與IgA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.53，P<0.05)，其他各指標(biāo)之間無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表4 年齡、ALT和PTA與T淋巴細(xì)胞亞群及免疫5項(xiàng)水平之間的相關(guān)性

注：aP<0.05。

3 討論

我國(guó)HBV感染者比例約為7.18%，由于各類(lèi)型嗜肝病毒之間缺乏交叉免疫，HBV感染者仍存在重疊感染HEV的可能[6，14-15]。機(jī)體免疫參與HBV或HEV感染的病程，但HBV重疊感染HEV患者機(jī)體免疫狀態(tài)的改變以及與HBV重疊感染HEV患者相關(guān)的臨床因素鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，HBV與HEV重疊感染患者CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于HEV感染患者，PTA水平降低與HBV重疊感染HEV獨(dú)立相關(guān)。

HBV與HEV重疊感染患者的肝功能損害程度可能重于HEV感染者。有研究報(bào)道，HBV與HEV重疊感染患者TBIL和ALT水平明顯高于HEV感染患者，而PT和PTA明顯低于HEV感染者[15]。本研究結(jié)果顯示，HBV與HEV重疊感染組患者PTA水平明顯低于HEV感染組，但是ALT水平低于HEV感染組，而TBIL水平與HEV感染組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；該結(jié)果提示，與ALT和TBIL比較，PTA更能持久反映肝功能損害的嚴(yán)重程度。

HBV與HEV重疊感染對(duì)患者肝功能的損害可能與HBV、HEV感染類(lèi)似，同樣依賴(lài)于宿主免疫系統(tǒng)作用于肝細(xì)胞[16-18]。有研究表明，HEV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)顯著高于無(wú)HEV感染者[19]。另有研究報(bào)道，與健康者比較，HEV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群在急性感染期和恢復(fù)期差異并不顯著[20]。本研究中，HBV與HEV重疊感染患者CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于HEV感染患者。為了進(jìn)一步探討HBV重疊感染HEV患者肝功能損傷與機(jī)體免疫狀態(tài)之間的關(guān)系，本研究選擇了年齡、ALT和PTA這3個(gè)最有可能反映重疊感染患者特征的臨床因素，進(jìn)一步分析其與淋巴細(xì)胞亞群及免疫5項(xiàng)水平之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示，PTA與C3水平呈正相關(guān)，與IgA水平呈負(fù)相關(guān)。提示PTA與體液免疫調(diào)節(jié)存在部分交叉，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，與HEV感染患者相比，HBV與HEV重疊感染患者CD8+T淋巴細(xì)胞明顯下降。PTA與HBV重疊感染HEV密切相關(guān)，是重疊感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示針對(duì)CD8+T淋巴細(xì)胞和PTA改善肝細(xì)胞功能的治療策略可能是此類(lèi)患者臨床治療的一種選擇。同時(shí)應(yīng)當(dāng)注意，本研究也存在著不足，如HBV重疊感染HEV患者的病例數(shù)較少，重疊感染前的基礎(chǔ)免疫狀態(tài)未進(jìn)行評(píng)估，病程中機(jī)體免疫狀態(tài)的動(dòng)態(tài)演變及其對(duì)病程轉(zhuǎn)歸的影響，仍值得進(jìn)一步研究。