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(1.湖北工業(yè)大學(xué),湖北武漢 430068; 2.江蘇省茶葉研究所,江蘇無(wú)錫 214000)

茶起源于中國(guó)西南地區(qū),是世界范圍內(nèi)最流行,消費(fèi)最廣泛的飲料之一[1]。據(jù)報(bào)道,茶葉內(nèi)含物質(zhì)可以預(yù)防多種疾病,如心血管疾病疾病[1],癌癥[2],抑郁癥[3],并有助于減輕體重[4]。多酚作為茶葉中主要生物活性物質(zhì),被廣泛報(bào)道在降低疾病風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮重要作用[5-6]。近年,來(lái)自植物中的多酚類(lèi)化合物尤其是原花青素，因其獨(dú)特的生物活性受到廣泛關(guān)注[7-9]。原花青素是以黃烷-3-醇為基礎(chǔ)單元,通過(guò)C4-C8或C4-C6鍵連接的一類(lèi)多酚類(lèi)化合物,分為單體,低聚,高聚原花青素[10]。復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和不同的組成賦予了原花青素多種生物和生化特性。其存在于植物的許多器官和組織,以增加抗病能力,強(qiáng)化植物組織和限制微生物生長(zhǎng)[11-13]。這些特性不僅體現(xiàn)在對(duì)植物的保護(hù),同樣體現(xiàn)在對(duì)入體健康潛在的生物活性[14-16]。早在上世紀(jì),研究入員就對(duì)茶葉中部分原花青素進(jìn)行了初步研究[17],由于條件限制,目前研究者對(duì)不同茶葉尤其是特殊品種中茶葉內(nèi)低聚及高聚原花青素組分及生物活性知之甚少。

紫娟是一種高花青素茶樹(shù)品種,是中國(guó)西南大葉喬木古茶樹(shù)的變種。茶樹(shù)有紫色的芽,莖和葉子;淡紫色的果皮和花萼。據(jù)報(bào)道,紫娟提取物具有潛在的功效,如降血壓、降血糖、減肥[18-19],抑菌[20],預(yù)防炎癥[21]及治療阿爾茲海默病[22]等。迄今為止,紫娟中關(guān)于原花青素的含量,組分結(jié)構(gòu)和其在紫娟功效中所扮演的角色罕見(jiàn)報(bào)道。大量報(bào)道稱,植物中的原花青素對(duì)α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制活性,可以有效降低入體攝入葡萄糖的吸收率[23-25],具有成為糖尿病及減肥藥物的潛力。因此，本研究提取純化了紫娟花原花青素，測(cè)定了提取物中原花青素含量，采用UPLC-MS對(duì)紫娟原花青素組分進(jìn)行鑒定，并評(píng)價(jià)其對(duì)α-淀粉酶的抑制活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫娟 采自江蘇宜興茶葉研究所玉山基地,經(jīng)過(guò)蒸青處理后烘干粉碎,過(guò)60目篩,于-5 ℃保存?zhèn)溆?甲醇、香草醛、濃硫酸、乙醇、磷酸鈉、氯化鈉、甲腈、二硝基水楊酸;AB-8大孔樹(shù)脂 上海一基實(shí)業(yè)有限公司;Sephadex LH-20 上海摩速科學(xué)器材有限公司;原花青素標(biāo)準(zhǔn)品 南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司;α-淀粉酶 ≥4000 U/g,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EGCG 湖南三為生物科技有限公司。

GZX-9023臺(tái)式電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;TD4C臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;ME-T 分析天平 瑞士Mette公司;DK-320恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FD-1A-80真空冷凍干燥機(jī) 上海豫明儀器有限公司;UV-2350紫外光分光光度計(jì) 尤尼科儀器有限公司;DL-720E超聲波清洗機(jī) 上海之信儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;超高效液相色譜:Waters UPLC,檢測(cè)器:WATERS ACQUITY PDA,色譜柱:BEH C-18 2.1 mm×50 mm 1.7 μm,飛行時(shí)間質(zhì)譜器:WATERS SYNAPT MS,Masslynx4.1,質(zhì)譜色譜管理軟件。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫娟原花青素粗提取 稱取紫娟樣品10.00 g放入500 mL錐形瓶中[4],加入300 mL的70%丙酮溶液，超聲20 min(功率300 W，頻率40 kHz),重復(fù)2次,將提取液放入離心機(jī)中，以3000 r/min的速度離心20 min,合并提取液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑后,冷凍干燥,獲得原花青素粗提物。

1.2.2 紫娟中原花青素粗提物純化 用50 mL純水將紫娟原花青素粗提物1.86 g溶解[4],將預(yù)處理好的樹(shù)脂濕法裝柱,以1.5 BV/h的速度讓原花青素提取液通過(guò)大孔樹(shù)脂柱至吸附飽和后,水洗至洗脫液為無(wú)色,用10%乙醇洗至洗脫液為無(wú)色,以去除部分雜質(zhì);再用70%丙酮洗脫,洗脫液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、用水稀釋、冷凍真空干燥后,制得原花青素精制品粉末,冷藏備用。

1.2.3 原花青素定量分析 利用香草醛-硫酸比色法對(duì)原花青素進(jìn)行定量分析[4,8-11]。分別配制1 g/100 mL的香草醛-甲醇溶液及50%硫酸溶液,將二者按體積比1∶1充分混勻,得工作液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品,以甲醇溶解,分別配置成0.2,0.3,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別準(zhǔn)確移取0.5 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL試管中,加入5 mL工作液,放入30 ℃的水浴鍋中避光反應(yīng)15 min后，取出靜置至室溫。以甲醇為空白對(duì)照,于497 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 mg原花青素精制品粉末,用甲醇溶解定容至50 mL,移取0.5 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL試管中,加入5 mL工作液,放入30 ℃的水浴鍋中避光反應(yīng)15 min后取出靜置至室溫,于497 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS) 將1 g原花青素精制品粉末溶于30%甲醇,以1 BV/h的速度讓原花青素溶解液通過(guò)Sephadex LH-20柱至吸附飽和后,然后在預(yù)處理的Sephadex LH-20柱上用30%甲醇處理4 h,用30%甲醇洗滌直至洗脫液變成無(wú)色,洗脫酚酸,糖苷等物質(zhì),吸附的多酚部分隨后被70%丙酮水溶液(500 mL)洗脫,并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)在真空下除去有機(jī)溶劑,凍干干燥。后準(zhǔn)確稱取10 mg樣品,用甲醇溶解定容至10 mL(現(xiàn)配現(xiàn)用),采用UPLC-MS法對(duì)紫娟原花青素進(jìn)行定性分析[4]。

色譜條件:色譜柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:水(A)和乙腈(B);流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 洗脫梯度程序Table 1 Elution gradient procedure

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源,負(fù)離子模式;離子掃描范圍m/z 200～1200;霧化氣溫度350 ℃;電噴霧電壓-4000 V;源內(nèi)碎裂電壓135 V。

1.2.5α-淀粉酶抑制活性的測(cè)定 分別配制0.25 mL的0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液,0.5 mg/mLα-淀粉酶溶液和0.5 mL不同濃度的紫娟原花青素精制品溶液及EGCG溶液(0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL),在37 ℃下反應(yīng)10 min[4]。反應(yīng)后,在每個(gè)試管中加入0.5 mL的1%淀粉溶液,混合物在37 ℃下反應(yīng)10 min,反應(yīng)用1.0 mL二硝基水楊酸試劑停止,然后將試管放入沸水浴中5 min并冷卻至室溫。反應(yīng)混合物加入10 mL蒸餾水,采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在540 nm測(cè)量。將阿卡波糖磨成粉末采用超聲法制成溶液作為對(duì)照。應(yīng)用下列公式計(jì)算對(duì)α-淀粉酶的抑制活性。

I(%)=(V空白-V樣品)/V樣品×100

式中:I為抑制劑對(duì)α-淀粉酶的抑制率(%),V空白為未添加抑制劑的空白實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)速度(mg/min);V樣品為添加了待測(cè)抑 制劑樣品的反應(yīng)速度(mg/min)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行,采用Origin 8.0和SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ANOVA進(jìn)行鄧肯氏(Duncan’s)差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫娟原花青素定量分析

從紫娟中提取出原花青素粗制品如1.2.1所述,提取率為18.6%(干重)。使用AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)一步純化紫娟原花青素,得到1.18 g精制品。以A497值(Y)和原花青素標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)作回歸方程為:y=8.7363x+0.4248,R2=0.9993。紫娟原花青素精制品以此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定(圖1),純度達(dá)93%,表明紫娟茶中含有大量原花青素。

圖1 原花青素分光光度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Curve of spectrophotometric spectrophotometry

2.2 紫娟原花青素的UPLC-ESI-MS分析

紫娟原花青素UPLC色譜圖如圖2所示,通過(guò)UPLC-ESI-MS在負(fù)離子模式下分析,結(jié)果總結(jié)在表2中。在紫娟原花青素中,至少有3種單體和7種原花青素低聚物被檢測(cè)并鑒定。相較于聚合的原花青素,單體原花青素(也被稱為兒茶素,如:C,EC,GC,EGC,ECG,EGCG)更加豐富。原花青素單體主要由表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG),表兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGC)和表沒(méi)食子兒茶素(ECG)組成,其相對(duì)分子質(zhì)量為458和442。原花青素單體還包括(+)-兒茶素(C),(-)-表兒茶素(EC)和沒(méi)食子兒茶素(CG),其相對(duì)分子質(zhì)量為290和 306,這些單體相應(yīng)的準(zhǔn)分子離子[M-H]-m/z分別為:457,441,289,305。各單體通過(guò)C4-C6或C4-C8鍵相連,形成二聚體、三聚體、四聚體等多聚體。

圖2 紫娟原花青素精制品的超高效液相色譜圖Fig.2 Zijuan proanthocyanidins products by ultra-high performance liquid chromatography

對(duì)單體來(lái)說(shuō),二聚體的分離比較困難,其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)也較復(fù)雜,除推斷出準(zhǔn)分子離子外,還必須提供了一系列碎片離子信息。從表2中m/z 761,m/z 745,m/z 729,m/z 865,m/z 881,m/z 609和m/z 593的質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以得出,二聚體至少有7種,保留時(shí)間分別為 4.46、6.39、7.28、7.50、8.53、8.62、9.40,根據(jù)準(zhǔn)分子離子數(shù)據(jù),推斷這些二聚體均為B型原花青素二聚體,并且有6種屬于酯、棓型二聚體原花青素,與許多傳統(tǒng)原花青素提取植物如葡萄籽相比,如此多種類(lèi)的酯、棓型二聚體原花青素是罕見(jiàn)的。以下是原花青素在質(zhì)譜中裂解的主要模式。

原花青素聚合體的碎裂方式主要包括黃烷醇間連接鍵的斷裂(QM)、逆狄爾斯-阿德(RAD)反應(yīng)和雜環(huán)裂解(HRF)反應(yīng)。HRF反應(yīng)為聚合體失去1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量126的中性分子。RAD反應(yīng)是黃烷醇C-環(huán)上發(fā)生斷裂,失去1個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為152的中性的結(jié)構(gòu)(C8H8O3)。黃烷醇間斷裂(QM)有2種可能,一種是失去僅以C4鍵與其他單元相連頂部單元T-unit(TOP)中性碎片,形成m/z為288的離子;另一種可能是失去以C6或C8鍵與其他單元相連的底部單元B-unit(BASE),形成m/z為290的碎片片段。

2.2.1 二聚體m/z 761結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 761二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為125,305,423,591。碎片離子m/z 591為m/z 761通過(guò)RAD反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 609,m/z 609進(jìn)一步脫水生成m/z 591;碎片離子m/z 423為m/z 761通過(guò)RAD 反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 609,m/z 609通過(guò)RAD 反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 441,進(jìn)一步脫水生成m/z 423;碎片離子m/z 305為m/z 761通過(guò)RAD 反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 609,m/z 609發(fā)生QM裂解類(lèi)黃酮連接鍵產(chǎn)生的;碎片離子m/z 125為HRF反應(yīng)為聚合體失去的中性分子?？赏茰y(cè)其結(jié)構(gòu)為(E)GC-(E)GCG二聚體,其同分異構(gòu)體共4種,結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3 二聚體m/z 761可能結(jié)構(gòu)式Fig.3 Dimer m/z 761 possible structural formula

2.2.2 二聚體m/z 745結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 745二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為169,407,423,593。碎片離子m/z 593為m/z 745通過(guò)RAD反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 593;碎片離子m/z 423產(chǎn)生方式同上;m/z 407為m/z 745通過(guò)RAD反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 593,m/z 593的T單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z 425,由m/z 425中B環(huán)相鄰酚羥基脫水產(chǎn)生?？赏茰y(cè)其結(jié)構(gòu)為(E)CG-(E)GC二聚體,其同分異構(gòu)體共4種,結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

表2 紫娟原花青素的分析Table 2 Analysis of proanthocyanidin from Zijuan

圖4 二聚體m/z 745可能結(jié)構(gòu)式Fig.4 Dimer m/z 745 possible structural formula

2.2.3 二聚體m/z 729結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 729二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為125,245,407,577。碎片離子m/z 577為m/z 729通過(guò)RAD反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 577;m/z 407為m/z 729通過(guò)RAD 反應(yīng)裂解產(chǎn)生m/z 577,m/z 577的T單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生m/z 425,由m/z 425中B環(huán)相鄰酚羥基脫水產(chǎn)生。m/z 245由m/z 729發(fā)生QM裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 289,后脫二氧化碳產(chǎn)生;可推測(cè)其結(jié)構(gòu)為(E)C-(E)CG二聚體,其同分異構(gòu)體共4種,結(jié)構(gòu)式如圖5所示。

圖5 二聚體m/z 729可能結(jié)構(gòu)式Fig.5 Dimer m/z 729 possible structural formula

2.2.4 三聚體m/z 865結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 865二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為125,407。m/z 407是由原花青素三聚體分子離子m/z 865發(fā)生QM裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 577,m/z 577發(fā)生RDA裂解生成m/z 425再脫水生成m/z 407;碎片離子m/z 125為HRF反應(yīng)為聚合體失去的中性分子。可推測(cè)其結(jié)構(gòu)為三單元兒茶素或表兒茶素三聚體,其同分異構(gòu)體共8種,如圖6所示。

圖6 三聚體m/z 865可能結(jié)構(gòu)式Fig.6 Dimer m/z 865 possible structural formula

2.2.5 二聚體m/z 881結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 881二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為169,407,577。m/z 577是由原花青素二聚體分子離子m/z 881發(fā)生QM裂解產(chǎn)生碎片離子m/z 577,m/z 407是由m/z 577發(fā)生RDA裂解生成m/z 425再脫水生成?？赏茰y(cè)其結(jié)構(gòu)為ECG-ECG,如圖7所示。

圖7 二聚體m/z 881可能結(jié)構(gòu)式Fig.7 Trimer m/z 881 possible structural formula

2.2.6 二聚體m/z 609結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 609二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為125,305,423。碎片離子m/z 423為m/z 609通過(guò)RAD 反應(yīng)裂解產(chǎn)m/z 441,進(jìn)一步脫水生成m/z 423;m/z 305是由m/z 609發(fā)生QM裂解類(lèi)黃酮連接鍵產(chǎn)生的;碎片離子m/z 125為HRF反應(yīng)為聚合體失去的中性分子?？赏茰y(cè)其結(jié)構(gòu)為(E)GC-(E)GC,如圖8所示。

圖8 二聚體m/z 609可能結(jié)構(gòu)式Fig.8 Trimer m/z 609 possible structural formula

2.2.7 二聚體m/z 593結(jié)構(gòu)解析 由表2可知,m/z 593二級(jí)質(zhì)譜碎片離子為289,305,407,423。碎片離子m/z 423為m/z 593通過(guò)RAD 反應(yīng)裂解產(chǎn)m/z 441,進(jìn)一步脫水生成;;m/z 441是由 m/z 593的B單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生,m/z 425由 m/z 593的T單元發(fā)生RDA裂解產(chǎn)生;m/z 423由m/z 441中B環(huán)相鄰酚羥基脫水產(chǎn)生;m/z 289與305是由m/z 593發(fā)生QM類(lèi)黃酮連接鍵產(chǎn)生的。可推測(cè)其結(jié)構(gòu)為(E)C-(E)GC,如圖9所示。

圖9 二聚體m/z 593可能結(jié)構(gòu)式Fig.9 Trimer m/z 593 possible structural formula

對(duì)于分子量大于1000的原花青素,很難進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析,質(zhì)譜圖中各個(gè)聚合物的分子離子峰的強(qiáng)度并不一定真實(shí)的反映聚合物分子在原花色素混合物中的組成情況,這是因?yàn)椴煌Y(jié)構(gòu)的原花色素離子化效率不同,分子量較小的聚合物離子化后的產(chǎn)物更快到達(dá)檢測(cè)器,從而使得混合物中相同比例的小分子和高分子沒(méi)有相等的離子峰強(qiáng)度,高分子甚至不出峰[26]。

2.3 紫娟原花青素精制品對(duì)α-淀粉酶活性的抑制效果

原花青素,EGCG和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶抑制效果如圖10所示,原花青素,阿卡波糖和EGCG對(duì)α-淀粉酶的IC50值分別為(0.7±0.02)、(0.9±0.01)、(2.0±0.01) mg/mL。所有樣品的抑制率都隨著濃度的增加而增加。在測(cè)試樣品中原花青素體現(xiàn)了與阿卡波糖類(lèi)似的抑制活性。EGCG較原花青素精制品和阿卡波糖相比效果較差,根據(jù)UPLC液相圖譜及文獻(xiàn)[5,9],我們可以推斷EGCG是原花青素中最主要的成分,據(jù)文獻(xiàn)[4,8-11]報(bào)道原花青素單體對(duì)α-淀粉酶抑制效果較弱,多聚原花青素抑制活性要高于原花青素單體,由此我們可以推測(cè)多聚原花青素α-淀粉酶活性抑制效果要高于原花青素單體,并有潛力可以取代阿卡波糖成為新型治療糖尿病的藥物,但是本次為體外實(shí)驗(yàn),考慮到入體吸收,體內(nèi)環(huán)境及多種因素,后續(xù)可以進(jìn)行更為詳盡的實(shí)驗(yàn)。

圖10 阿卡波糖、EGCG和原花青素精制品抑制活性比較圖Fig.10 Comparison of inhibitory activity of acarbose,EGCG and procyanidins

3 結(jié)論

紫娟茶中含有大量的原花青素,有3種單體和7種原花青素低聚物被檢測(cè)并鑒定,絕大多數(shù)是酯、棓型原花青素二聚體。相較于聚合的原花青素,單體原花青素更為豐富。原花青素對(duì)α-淀粉酶抑制作用隨濃度而增大。本研究結(jié)果表明，從紫娟中分離出的原花青素具有有效的α-淀粉酶抑制活性,較傳統(tǒng)藥物阿卡波糖有更好的抑制效果,有成為抗糖尿病及減肥藥物的潛力。