高艷軍，邢志偉，杜月菊，徐美麗，李 剛，王世博

(1.河北省胸科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，河北 石家莊050041;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 感染控制處，河北 石家莊050000)

當(dāng)前白血病的治療主要包括化療，骨髓移植和一些靶向治療，而化療的毒副作用強(qiáng)，骨髓移植配型成功的幾率比較低，故靶向治療展現(xiàn)出巨大的潛能。近年來一些靶點(diǎn)突變體的發(fā)現(xiàn)對(duì)于白血病的病理機(jī)制研究提供新了的視角，同時(shí)也促進(jìn)了靶向治療的發(fā)展。美國首先應(yīng)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿┌邢蛑委熌[瘤[1]。

染色體DNA復(fù)制是一個(gè)高度調(diào)節(jié)的過程，涉及到大量的必需和非必需的蛋白因子，有效的DNA解螺旋是基因復(fù)制必要的先決條件，在真核生物中，MCM(微型染色體維持)蛋白復(fù)合體，是一種復(fù)制解螺旋酶，包括6個(gè)亞基(MCM2-MCM7)，但是MCM本身發(fā)揮極微弱的解旋功能，需要兩個(gè)輔助因子GINS家族成員和Cdc45輔助完成[2-5]。GINS2也被稱為PSF2，是GINS家族成員之一。GINS家族成員還包括GINS1，GINS3和GINS4，它們是真核生物復(fù)制叉的重要組成部分，在復(fù)制起始階段發(fā)揮重要作用[6-9]。臨床證據(jù)顯示GINS2作為致癌基因可以出現(xiàn)在不同的惡性腫瘤中[10]。本文以GINS2作為靶基因，通過腺病毒載體感染白血病細(xì)胞NB4 細(xì)胞(人急性早幼粒白血病細(xì)胞)，觀察過表達(dá)GINS2基因?qū)B4 細(xì)胞增殖的影響，為白血病基因診療靶點(diǎn)篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 購于美國的Invitrogen 公司；RNA 提取試劑Trizol購于日本的Takara 公司；鼠抗β-actine多克隆抗體，兔抗GINS2 多克隆抗體購于美國的Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和山羊抗小鼠IgG 購于北京的中杉金橋生物技術(shù)公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購于杭州的四季青生物制品公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司；MTT(噻唑藍(lán)試劑)購于Sigma公司；人胚腎293和K562細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫；Ad-GINS2腺病毒和空載由河北省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科保存。

1.2PCR檢測NB4細(xì)胞GINS2基因的轉(zhuǎn)錄水平將NB4 細(xì)胞接種于75 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)24 h，Ad-GINS2感染NB4 細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄，采用GINS2 上下游引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，上游引物：5’-CGCGGATCCACCACCATGGACGCTGCC GA-3’，下游引物：5’-CCC AAGCTTCTAGAAGTCCTGAGACTGAGTAC-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為558 bp。 PCR 反應(yīng)條件如下：預(yù)變性 95℃，50 s；58℃，35 s；72℃，5 min；共35 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。本文選GAPDH為內(nèi)參，上游引物:5’-GCTGAGTATGTCGTGGAG-3’,下游引物：5’-TCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為286 bp。PCR 反應(yīng)條件如下：預(yù)變性 95℃，50s；60℃，35 s；72℃，5 min；共30 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min?？蛰d病毒感染NB4細(xì)胞作為空載組，以未添加病毒的細(xì)胞作為未處理組。1.5%瓊脂糖凝膠電泳并成像。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3WesternBlot檢測NB4細(xì)胞中GINS2蛋白水平將NB4 細(xì)胞接種于75 ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)24 h，Ad-GINS2感染感染NB4 細(xì)胞，72 h后提取細(xì)胞蛋白，BCA方法定量 。每孔上樣50 μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳分離后，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，分別加入一抗(1∶600兔抗GINS2多抗；1∶500鼠抗β-actin多抗)，37 ℃孵育3 h，TBST洗膜3次。分別加入IgG/HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)和IgG/HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1000)室溫孵育1 h， TBST洗膜3次，經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯色。以β-actin作對(duì)照，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次?？蛰d病毒感染NB4細(xì)胞作為空載組，以未添加病毒的細(xì)胞作為未處理組。

1.4MTT法檢測Ad-GINS2感染NB4細(xì)胞后的生長情況選對(duì)數(shù)期生長的NB4 均勻接種在96 孔板中，每孔接種量為1×104個(gè)，每孔200 μl,實(shí)驗(yàn)分組為：未處理組，空載組，感染組。每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別在感染24、48、72 和96 h后，毎孔加入100 μl MTT溶液，培養(yǎng)4 h 后棄掉上清液，毎孔加入200 μl DMSO，室溫?fù)u床振蕩10 min，酶標(biāo)儀492 nm波長處測定。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活力(%)=處理組OD值/空白對(duì)照組OD值×100%。

2 結(jié)果

2.1Ad-GINS2感染NB4細(xì)胞的熒光表達(dá)情況Ad-GINS2 感染NB4細(xì)胞，感染72 h后，觀察紅色熒光表達(dá)情況(圖1)。

A、B感染72 h后紅色熒光表達(dá)情況

2.2NB4細(xì)胞GINS2基因的轉(zhuǎn)錄水平通過RT-PCR檢測GINS2 基因的表達(dá)情況。Ad-GINS2感染組與空載組和未處理組相比，感染組GINS2 表達(dá)顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為4.726和9.865，P均<0.05,圖2)，提示重組腺病毒成功感染NB4細(xì)胞并過表達(dá)目的基因。

1.空載組；2.Ad-GINS2感染組；3.未處理組；M：Marker DL2000

2.3NB4細(xì)胞中GINS2蛋白表達(dá)水平將NB4細(xì)胞接種于75 ml的培養(yǎng)瓶中，病毒感染72 h后，收獲細(xì)胞并提取蛋白，免疫印跡法檢測GINS2 蛋白的表達(dá)情況。Ad-GINS2感染組與空載組和未處理組相比，感染組GINS2 表達(dá)水平明顯上調(diào)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值為17.88和3.53，P均<0.05,圖3)，提示重組腺病毒Ad-GINS2成功感染NB4 細(xì)胞并且過表達(dá)目的蛋白。

1.空載組；2.Ad-GINS2感染組；3.未處理組

2.4GINS2基因過表達(dá)對(duì)NB4細(xì)胞增殖的影響MTT分析結(jié)果顯示，Ad-GINS2感染組與空載組和未處理組相比，第1 d(t值為3.455和2.234，P均>0.05)和第2 d(t值為0.417和1.383，P均>0.05)無明顯變化，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第3 d(t值為15.15和11.84，P均<0.05)和第4 d(t值為8.476和9.896，P均<0.05)。結(jié)果顯示重組腺病毒Ad-GINS2能明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖4)。

*P<0.05與空載組和未處理組比較

3 討論

急性髓細(xì)胞白血病是一類惡性克隆性疾病，往往預(yù)后不良，以多基因水平、多細(xì)胞水平、分子水平等多步驟發(fā)生異常為主要特征，從而導(dǎo)致不同種類的白血病治療方案的差異，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，一些突變基因的發(fā)現(xiàn)，為進(jìn)一步完善白血病靶向治療提供了新的視角[11-15]。

在前期實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)在白血病細(xì)胞 cDNA 文庫中對(duì)與 PML-C相互作用的蛋白進(jìn)行了篩選,其中首次發(fā)現(xiàn)GINS2與 PML-C在酵母細(xì)胞內(nèi)存在相互作用且通過免疫共沉淀技術(shù)得到一步驗(yàn)證，并且通過沉默GINS2 基因可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加，抑制細(xì)胞生長和活性。參閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，GINS2在乳腺癌，黑色素瘤等惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)升高，并促進(jìn)了其發(fā)生和發(fā)展[16-18]，但其在急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞中的功能少有報(bào)道。為了進(jìn)一步研究 GINS2 表達(dá)與腫瘤發(fā)生的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建重組腺病毒載體技術(shù)過表達(dá)GINS2基因，觀察GINS2基因?qū)Π籽〖?xì)胞NB4細(xì)胞體外增殖能力的影響，細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GINS2基因過表達(dá)之后能進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖。但具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在白血病NB4細(xì)胞中，GINS2蛋白在白血病細(xì)胞的生長發(fā)育中發(fā)揮重要的作用，為白血病的靶向治療篩選新的靶點(diǎn)提供新的思路。