吳東垣，劉 煒，李雙斌，崔 燕，祝金明

(1.吉林市中心醫(yī)院，吉林 吉林132011；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院)

5-氟尿嘧啶(5-FU)被廣泛用于治療乳腺癌、婦科和胃腸癌癥[1]，可以抑制胸苷的活性，在細(xì)胞周期的S期抑制DNA的合成[1，2]，也能抑制RNA合成和加工[3]。5-FU的副作用主要包括白細(xì)胞減少、口腔炎、心臟毒性和消化系統(tǒng)癥狀[4,5]。5-FU的心臟毒性給患者帶來嚴(yán)重威脅[6]。有研究表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生反應(yīng)性氧化物(ROS)是化療藥物產(chǎn)生心臟毒性的主要機(jī)制[7，8]，這將導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、凋亡、心室重構(gòu)等，進(jìn)一步導(dǎo)致心力衰竭[9]。黃芪多糖(APS)是黃芪的主要成分，在心肌缺血的治療中有顯著效果[10]，可改善冠脈血流量，降低過氧化脂質(zhì)含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)活性，從而保護(hù)心臟[11-13]。然而，APS是否可以改善5-FU誘導(dǎo)的心臟毒性仍然未知。本研究旨在探討APS是否可以緩解氧化應(yīng)激，抑制5-FU誘導(dǎo)的心肌損傷。

1 材料與方法

1.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)

取出大鼠心臟后，用Ⅱ型膠原酶(Worthington)溶液消化。消化2 h后，收集心肌細(xì)胞。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

8周齡雄性SD大鼠，隨機(jī)分為3組，灌胃飼養(yǎng)7天：第1組：生理鹽水組；第2組：5-FU(1 mg/kg體重)；第3組：5-FU+ APS(1.5 g/kg體重)。在此之后，切除心臟并提取蛋白質(zhì)。

1.3 細(xì)胞增殖測(cè)定

心肌細(xì)胞在1%明膠包被的96孔組織培養(yǎng)板中以5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)。 24 h后，5-FU溶解在DMSO中，以1 nM、10 nM、100 nM和1 mM的最終濃度加入培養(yǎng)基中。DMSO加入作為陰性對(duì)照。MTT試劑以0.5 mg/ml的終濃度加入每個(gè)孔，在37℃溫育5 h。然后，除去培養(yǎng)基，每孔加入100 μl DMSO溶解結(jié)晶。使用微板讀數(shù)器測(cè)定每孔570 nm下的吸光度。此外，將細(xì)胞用100 nM 5-FU預(yù)培育12、24、48和72 h，并以相同的方法測(cè)定細(xì)胞生存力。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行至少3次。

1.4 活性氧檢測(cè)

細(xì)胞在六孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)，24 h后，以1 nM、10 nM、100 nM和1 mM終濃度的5-FU處理細(xì)胞。48 h后，收集心肌細(xì)胞，離心，在PBS中洗滌3次(5 min/次)。然后將載玻片用5 μM DHE(Vigorous Biotechnology Beijing Co.,Ltd)在無血清的DMEM F-12培養(yǎng)基中37℃黑暗處理30 min。將細(xì)胞在4%多聚甲醛中室溫下固定30 min。將載玻片用冷PBS洗滌3次并置于顯微鏡下。免疫熒光圖像通過熒光顯微鏡捕獲。用流式細(xì)胞儀(BD公司)分析相對(duì)熒光強(qiáng)度，檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.5 Western blot分析

用細(xì)胞裂解緩沖液(Cell Signaling Technology公司)裂解細(xì)胞并收集總裂解物，使用BCA蛋白質(zhì)(Millipore，Billerica，MA，USA)測(cè)定蛋白濃度。等量蛋白用12%的SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Millipore，Billerica，MA，USA)。將膜用5%(重量/體積)脫脂奶粉在室溫下孵育2 h。該膜與一抗兔抗人eNOS和Bcl-2、Bax和GAPDH(細(xì)胞信號(hào))一起溫育?？贵w根據(jù)制造商的說明，在5%牛血清白蛋白稀釋。然后加入辣根過氧化物酶綴合的二抗，并使用化學(xué)發(fā)光儀(ECL，Amersham Biosciences公司)通過放射自顯影檢測(cè)所產(chǎn)生的信號(hào)。GAPDH作為內(nèi)參。

1.6 酶活性測(cè)定

組織勻漿以2 000 rpm/min離心10 min。根據(jù)制造商的說明,使用檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京，中國(guó))測(cè)定總蛋白、SOD、過氧化氫酶(CAT)和MDA的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)被表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估。統(tǒng)計(jì)比較采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行，并采用Dunn’s方法以鑒別組間差異。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-FU顯著增強(qiáng)心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生

5-FU預(yù)處理顯著增強(qiáng)心肌ROS的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖1)。

圖1 5-FU顯著增強(qiáng)原代心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，并呈現(xiàn)劑量依賴性

2.2 5-FU降低原代心肌細(xì)胞活力，呈劑量和時(shí)間依賴性

MTT法用來研究5-FU對(duì)細(xì)胞活力的影響。如圖2A，5-FU孵育的心肌細(xì)胞在100 nM和1 mM濃度時(shí)，細(xì)胞活力顯著降低。同時(shí)，用100 nM 5-FU處理的心肌細(xì)胞，細(xì)胞活力在48 h和72 h分別下降了34.5%和42.3%(圖2B)。

(A)5-FU 100 nM和1 mM顯著降降低心肌細(xì)胞活力。(B)心肌細(xì)胞用100 nM 5-FU處理后48 h和72 h，細(xì)胞活力分別減少34.5%和42.3%。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，n=3獨(dú)立試驗(yàn)。*與對(duì)照組相比，P<0.05，**與對(duì)照組相比，P<0.01。

圖25-FU降低心肌細(xì)胞活力，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性。

2.3 5-FU在體內(nèi)誘導(dǎo)心臟毒性和細(xì)胞凋亡

在體外研究中發(fā)現(xiàn)與5-FU顯著增強(qiáng)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的活化(圖3A)。同時(shí)，凋亡抑制基因Bcl-2蛋白水平顯著降低，而凋亡基因Bax蛋白

水平顯著增強(qiáng)(圖3A)。在心肌細(xì)胞用100 nM 5-FU處理時(shí)，我們還檢測(cè)了SOD和丙二醛(MDA)含量。該數(shù)據(jù)表明，5-FU顯著降低SOD的含量而提高M(jìn)DA水平，這表明5-FU具有心臟毒性作用(圖3B和3C)。

(A)5-FU顯著增強(qiáng)caspase 3活性。(B)5-FU降低超氧化物歧化酶(SOD)的含量。(C)5-FU增強(qiáng)MDA的水平。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，n= 3獨(dú)立試驗(yàn)。*與對(duì)照組相比，P<0.05，**與對(duì)照相比，P<0.01。

圖35-FU體內(nèi)誘導(dǎo)心臟毒性和細(xì)胞凋亡

2.4 黃芪多糖通過調(diào)節(jié)活性氧的產(chǎn)生抑制5-FU誘發(fā)的心肌損傷

APS預(yù)孵育可以顯著逆轉(zhuǎn)SOD下降，降低MDA含量(圖4A)。 Western blot分析表明，APS治療可以降低5-FU誘導(dǎo)的caspase3的激活和Bax蛋白在體內(nèi)的表達(dá)水平。對(duì)比單獨(dú)5-FU處理組，APS治療可以上調(diào)Bcl2蛋白的表達(dá)水平(圖4B)。

3 討論

心臟損傷是化療藥物的嚴(yán)重副作用之一，顯著限制了其臨床應(yīng)用[14]。明確化療藥物心臟毒性的發(fā)生機(jī)制，可以降低化療藥物對(duì)正常組織的不良影響，改善腫瘤治療效果，具有重要意義。

5-FU已經(jīng)廣泛應(yīng)用于癌癥治療[15，16]。據(jù)報(bào)道，心臟毒性的發(fā)生率極高，范圍從20%至100%[17，18]。本研究中，對(duì)5-FU產(chǎn)生心臟毒性的具體機(jī)制進(jìn)行了探討，從而為制定預(yù)防心臟毒性的策略提供了有效參考。本研究中，我們使用不同濃度的5-FU處理心肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)它可以顯著提高ROS水平。此外，MTT結(jié)果顯示，5-FU處理可以降低心肌細(xì)胞活力并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性，而且5-FU明顯增強(qiáng)caspase 3活性。更重要的是5-FU可以降低SOD含量并增加MDA含量。這些體外實(shí)驗(yàn)表明，5-FU能誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞損傷。

(A)APS預(yù)孵育顯著提高SOD的水平，降低MDA含量。(B)APS降低5-FU誘導(dǎo)的caspase3激活和Bax的表達(dá)。數(shù)據(jù)代表平均值±SEM，n=3獨(dú)立試驗(yàn)。*與對(duì)照組相比，P<0.05，**與對(duì)照相比，P<0.01。

圖4黃芪多糖APS可通過調(diào)節(jié)ROS生成，改善5-FU引起的心臟損傷

黃芪多糖是具有悠久應(yīng)用歷史的傳統(tǒng)中藥，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低癌癥細(xì)胞的生長(zhǎng)并能減輕炎癥反應(yīng)[19]。已有研究表明，APS是一種有效的保護(hù)性藥劑，可以改善心臟損傷，例如可以抑制心肌肥大、改善心力衰竭[20]。在人類和動(dòng)物心臟衰竭模型中，心肌氧化應(yīng)激均可導(dǎo)致心室明顯擴(kuò)張[21，22]。ROS通常是由心肌細(xì)胞在化療藥物作用下釋放[23]。我們確定了ROS由5-FU以劑量依賴性方式誘導(dǎo)產(chǎn)生。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖主要通過緩解氧化應(yīng)激而抑制5-FU誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。因此，我們的研究為防治5-FU引起的心肌損傷提供了新的方法。