樊 威，賀 揚(yáng)，黃小麗，王 均，吳 俊，蘇 建，陳家榮，蔣 鑫，王 俊

( 1.四川省內(nèi)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，四川 內(nèi)江 641000； 2.內(nèi)江師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，四川 內(nèi)江 641000； 3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130； 4.四川省水產(chǎn)局，四川 成都 610000 )

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

主要試劑和藥品：胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、瓊脂粉[Oxoid公司(中國)]，DNA Marker、細(xì)菌DNA基因組提取試劑盒、2×Taq Master Mix[天根生化科技(北京)有限公司]；細(xì)菌生化微量鑒定管、氧化酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、吲哚、H2S、阿拉伯糖、衛(wèi)矛醇、V-P、DNase、藥敏紙片等(杭州微生物試劑有限公司)。

1.2 病癥觀察

1.3 病原菌的分離和培養(yǎng)

在無菌狀態(tài)下，對(duì)病魚肝、腎和脾進(jìn)行細(xì)菌分離，將其接種于LB瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單個(gè)優(yōu)勢菌落進(jìn)行細(xì)菌的分離純化后，進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)特征記錄并進(jìn)行鑒定。

1.4 病原菌的16S rRNA鑒定

將純化的細(xì)菌接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。收集菌體，按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌基因組DNA，使用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增序列經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。序列結(jié)果提交美國國立生物技術(shù)信息中心進(jìn)行序列比對(duì)，并運(yùn)用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。鑒定的細(xì)菌置于-20 ℃保存。

1.5 微量生物化學(xué)鑒定

根據(jù)PCR鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[7]和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》[8]中的方法進(jìn)行細(xì)菌的二次鑒定。采用細(xì)菌生化微量鑒定管法系統(tǒng)測定分離菌株生化特性，28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行葡萄糖、阿拉伯糖、吲哚、氧化酶、衛(wèi)矛醇、V-P反應(yīng)和精氨酸雙水解酶等生化試驗(yàn)。

1.6 動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)

1.7 藥敏試驗(yàn)

將純化的細(xì)菌接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。采用K-B紙片擴(kuò)散法[9]，在超凈工作臺(tái)中將200 μL試驗(yàn)菌液用滅菌涂布棒平鋪于LB瓊脂培養(yǎng)基上，蓋上培養(yǎng)皿蓋后置室溫干燥3～5 min，用鑷子將藥敏紙片貼于平板表面并適當(dāng)按壓，每個(gè)培養(yǎng)基表面貼5張各種藥敏試紙，4張均勻地貼在離培養(yǎng)皿邊緣15 mm處，一張位于中心。隨后將培養(yǎng)皿倒扣置于恒溫箱內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)16～18 h。測量抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片廠家推薦的抑菌范圍判斷結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病癥觀察

圖1 患病斑點(diǎn)叉尾a:頭部潰爛；b:胃積液膨大，腸系膜充血；c:肝腫大.

2.2 細(xì)菌的分離鑒定

2.2.1 形態(tài)特征

在腎臟中分離到優(yōu)勢菌株FW0606。該菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上生長為邊緣整齊、表面光滑的無色透明菌落。對(duì)該菌進(jìn)行分離純化后，進(jìn)行革蘭氏染色?！?000倍顯微鏡觀察顯示，該菌為革蘭氏陰性短桿菌(圖2)。

圖2 菌株FW0606的形態(tài)

2.2.2 16S rRNA PCR鑒定

圖3 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果M：DL2000 DNA Maker；1：陰性對(duì)照；2、3：16S rRNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的兩個(gè)重復(fù).

圖4 基于16S rRNA序列分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 微量生物化學(xué)鑒定

2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

2.5 藥敏試驗(yàn)

表1 菌株FW0606的生理生化特征

注：“-”示陰性，“+”示陽性.

圖5 人工感染試驗(yàn)結(jié)果

表2 愛德華氏菌FW0606藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論