閆碧軒，馬 玲

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801）

乳清中各種蛋白質(zhì)成分總稱(chēng)為乳清蛋白，它具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，有很多的功能特性，是最有價(jià)值的成分[1]。但乳清蛋白自身的某些性質(zhì)不利于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用，蛋白酶水解主要是克服其性質(zhì)局限的一種重要處理方法[2]，與堿法和酸法相比，酶法水解植物蛋白條件較溫和，而且產(chǎn)生毒性物質(zhì)的可能性很小，更重要的是水解效率較高。

經(jīng)研究，植物蛋白質(zhì)的水解還可以改善其品質(zhì)和溶解性、起泡性等功能特性，能夠提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3-4]。堿性蛋白酶水解乳清蛋白后的肽段更容易被人體吸收和利用，而且一些肽段還有某些特殊的生理功能，如降血壓、降膽固醇、抗菌、抗癌、鎮(zhèn)靜等。此外，通過(guò)酶法水解乳清蛋白，能夠降低乳清蛋白的致敏性[5]。因此，乳清蛋白的酶法水解處理技術(shù)研究和應(yīng)用具有改善營(yíng)養(yǎng)、擴(kuò)大應(yīng)用范圍的現(xiàn)實(shí)意義。試驗(yàn)研究乳清的水解工藝（包括水解溫度、水解初始pH值、水解時(shí)間、底物濃度對(duì)滅酶活的破壞等），對(duì)進(jìn)一步擴(kuò)大乳清的利用具有重要的影響意義。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

乳清，新鮮無(wú)抗牛乳制備干酪后所得到的副產(chǎn)物；堿性蛋白酶，山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；氫氧化鈉（分析純），天津市頂?；た倧S提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

pH值自動(dòng)控制儀，上海海雷磁儀器廠產(chǎn)品；水浴恒溫振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；ALC-210.2型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳清水解工藝流程

乳清→于80℃下振蕩水浴加熱15 min→調(diào)節(jié)pH值→降至所需溫度→酶法水解→加熱鈍化→測(cè)水解度。

1.3.2 水解度的測(cè)定[6]

水解開(kāi)始時(shí)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值為7.0，利用pH自動(dòng)控制儀實(shí)時(shí)對(duì)反應(yīng)體系的pH值進(jìn)行在線控制，以維持反應(yīng)體系恒定的pH值。每隔一定時(shí)間記錄濃度為0.5 mol/L的NaOH堿溶液的消耗量，按下式計(jì)算出乳清蛋白的水解度：

DH=B（Mb）（1/α）（1/Mp）（1/h）×100%.

式中：B——NaOH的體積，mL；

Mb——NaOH的濃度，mol/L；

Mp——水解液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；

h——每1 g原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，對(duì)于乳清濃縮蛋白而言，該值取8.8；

1/α——校正系數(shù)（堿性蛋白酶的1/α=1.01）。

1.3.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響乳清水解反應(yīng)的主要因素有水解溫度、初始pH值、酶與底物濃度比和水解時(shí)間。先進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在各單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化堿性蛋白酶對(duì)乳清蛋白的水解條件。對(duì)酶與底物濃度比（A）、初始pH值（B）、酶解溫度（C）和酶解時(shí)間（D） 進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 水解溫度對(duì)水解度的影響

溫度對(duì)酶解反應(yīng)效率的影響主要在酶催化反應(yīng)的速度和酶的穩(wěn)定性2個(gè)方面。通常情況下堿性蛋白酶的最適溫度隨著底物的不同而有所不同，但一般都是在50～60℃，將堿性蛋白酶的條件設(shè)定在pH值9，酶與底物濃度比（E/S） 0.03，對(duì)乳清蛋白水解3.0 h，以水解度為指標(biāo)，探討不同水解溫度條件下乳清的水解度。

水解溫度對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 水解溫度對(duì)水解度的影響

由圖1可知，隨著溫度越來(lái)越高，水解度越來(lái)越大。在40～50℃，水解度上升得比較緩慢；在50～60℃水解度上升的比較快，這個(gè)現(xiàn)象主要是因?yàn)閴A性酶在其最適溫度下，反應(yīng)物間分子間的接觸更加頻繁，50～60℃酶的活性比較強(qiáng)，反應(yīng)速度就比較快。水解溫度在60℃時(shí)效果最好，但是由于考慮到可能在此溫度水解后，會(huì)有美拉德反應(yīng)以致水解后的產(chǎn)物顏色變深，所以實(shí)際選擇的最適溫度為55℃。

2.2 初始pH值對(duì)水解度的影響

由結(jié)果可知，堿性蛋白酶最適溫度為55℃，設(shè)定酶和底物比（E/S） 為0.03，酶解時(shí)間3.0 h，水解度為指標(biāo)。

pH值對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)水解度的影響

由圖2可知，堿性蛋白酶的pH值為8時(shí)水解度較低；pH值在8.0～10.0時(shí)，水解度隨pH值的增加而加快；當(dāng)pH值超過(guò)10.0時(shí)水解度開(kāi)始下降，水解液的顏色越來(lái)越深。堿性蛋白酶在最大活性范圍內(nèi)，選用較低的pH值會(huì)減少反應(yīng)過(guò)程產(chǎn)生的鹽，所以最終選擇pH值為9。

2.3 酶與底物濃度比（E/S）對(duì)水解度的影響

由于在試驗(yàn)中堿性蛋白酶水解時(shí)，底物的量是絕對(duì)過(guò)量的，在決定酶的用量時(shí)，相對(duì)于酶的濃度，酶和底物濃度比可以更準(zhǔn)確地表現(xiàn)酶的反應(yīng)速率。因此，反應(yīng)速率是和E/S成正比的。由試驗(yàn)可知，pH值9，水解溫度55℃的條件合適。

E/S對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 E/S對(duì)水解度的影響

由圖3可知，E/S為0.03～0.05時(shí)，隨著E/S的增大，酶解液的水解度越來(lái)越大；E/S在0.05之后，水解度增加很緩慢。所以，從水解度的變化和生產(chǎn)成本綜合考慮，E/S選擇0.05。

2.4 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

由以上試驗(yàn)確定的值，設(shè)定酶解的條件為水解溫度55℃，pH值9，酶和底物比（E/S） 為0.05，以水解度為指標(biāo)。

水解時(shí)間對(duì)水解度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖4可知，在整個(gè)水解過(guò)程中，隨著時(shí)間不斷增加，水解度也越來(lái)越大，不過(guò)每個(gè)時(shí)間段增加的程度不一樣。在開(kāi)始的1 h內(nèi)，水解度增加的最快，主要是由于水解最開(kāi)始時(shí)，堿性蛋白酶主要作用的肽鍵數(shù)目最多，隨著水解時(shí)間的增加，肽鍵被斷開(kāi)的越來(lái)越多，水解底物中的肽鍵數(shù)越來(lái)越少，此后水解度增加的程度雖然仍然呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但越來(lái)越慢。為節(jié)約時(shí)間和能源，最終乳清蛋白的最適水解時(shí)間為3.0 h。

2.5 乳清水解條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，再對(duì)酶與底物濃度比、初始pH值、水解溫度和水解時(shí)間4個(gè)條件下進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定堿性蛋白酶水解乳清蛋白的最佳工藝參數(shù)組合。

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

由極差分析的結(jié)果可知，影響乳清蛋白水解度的因素主次關(guān)系為A＞B＞D＞C，即酶與底物濃度比＞初始pH值＞水解時(shí)間＞水解溫度。由于堿性蛋白酶水解中，底物是絕對(duì)夠量的，水解的程度則完全取決于酶的濃度，因此酶與底物濃度比是影響乳清蛋白水解度最大的因素，其次是pH值，最后是水解時(shí)間和水解溫度，由試驗(yàn)所得和正交分析可知最佳條件參數(shù)組合為A1B3C3D3，9個(gè)處理組合中水解度最高的也是A1B3C3D3組合，所以堿性蛋白酶水解乳清的最佳條件為水解溫度60℃，pH值10，E/S 0.06，水解時(shí)間4 h。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

由于乳清蛋白分子中有較多的疏水氨基酸殘基，因此堿性蛋白酶能對(duì)乳清蛋白進(jìn)行有效的水解。試驗(yàn)利用了正交試驗(yàn)對(duì)堿性蛋白酶水解乳清的條件進(jìn)行了研究，主要研究了水解乳清過(guò)程中酶與底物濃度比、初始pH值、水解溫度和水解時(shí)間對(duì)反應(yīng)的影響，并且對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，影響堿性蛋白酶水解乳清的因素按影響大小依次為酶與底物濃度比、初始pH值、水解時(shí)間、水解溫度。堿性蛋白酶水解乳清的最佳酶與底物濃度比0.06，初始pH值10，水解溫度60℃，水解時(shí)間4 h，在以上工藝條件下，乳清蛋白的水解度可達(dá)21.92%。