王萬里 ， 田耀旗 ， 謝正軍 *

（1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

淀粉主要在植物體內(nèi)合成，是食品工業(yè)的重要原料，醫(yī)藥、化工、紡織工業(yè)的主要配料[1]。淀粉合成與水稻胚乳中ADPG焦磷酸化酶（ADPGPase）、淀粉合成酶（SSase）、淀粉分支酶（SBE）和淀粉脫支酶（DBE）密切相關(guān)[2]。其中，SSase是一種葡萄糖轉(zhuǎn)移酶，以腺苷二磷酸葡萄糖（ADPG）為底物，通過α-1，4糖苷鍵不斷增加直鏈或者支鏈的葡糖糖單元[3]；SBE在支鏈淀粉形成過程中的作用機制是切斷α-1，4糖苷鍵并形成α-1，6糖苷鍵，與可溶性淀粉酶共同作用形成支鏈淀粉[4]。DBE能夠切去支鏈淀粉不規(guī)整的分支，在支鏈淀粉合成過程中也起重要作用[5]。然而，在灌漿期稻米成熟過程中，上述各大酶類活性呈動態(tài)變化，會引起淀粉精細結(jié)構(gòu)變化[6]。因此收割時間必然影響其在食品應(yīng)用中的性能，比如慢消化性和抗老化特性。

作 者 采 用 SEM、LPSA、XRD、HPLC-AEC、HPSEC-MALLS-RI技術(shù)，研究灌漿期間糯米淀粉形態(tài)、晶體、分子結(jié)構(gòu)變化，以期揭示糯稻米灌漿期成熟過程中淀粉精細結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，為篩選慢消化性、抗老化性等新型糯米淀粉食品的加工原料提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

灌漿期糯米：湖北黃岡市售產(chǎn)品；葡糖糖測定試劑盒（葡糖氧化酶法）：上海榮盛生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；異淀粉酶：1 000 u/mL，愛爾蘭megazyme公司產(chǎn)品。

掃描電子顯微鏡：Quanta-200型，荷蘭FEI公司產(chǎn)品；激光粒度分析儀：S3500型，美國Microtrac公司產(chǎn)品；X-射線衍射儀：D8-Advance型，德國Bruker AXS公司產(chǎn)品；高效尺寸排阻色譜聯(lián)合多角度激光檢測器和示差檢測器檢測系統(tǒng)；輸送泵：1525型，美國Waters公司產(chǎn)品；多角度激光檢測儀：DAWN HELEOSⅡ型，美國Wyatt公司產(chǎn)品；示差折光檢測器：2414型，美國Waters公司產(chǎn)品；高效陰離子交換色譜：ICS5000型，美國Dionex公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 灌漿期稻谷取樣 灌漿期糯米稻谷收割于湖北蘄春大別山區(qū)，灌漿時間分別為揚花后11、13、15、17、22、27 和 35 d，收割后冷凍干燥，然后置于自封袋密封于-50℃保存。

1.2.2 灌漿期淀粉提取 淀粉提取參考Chiou等人方法[7]，并略改進。脫殼后的糯米500 g于1 L質(zhì)量分數(shù)0.2%NaOH溶液浸泡24 h，去上清液后用NaOH溶液洗3次，磨碎，然后加入3 L質(zhì)量分數(shù)0.2%NaOH溶液，過膠體磨，再稀釋到5 L置于圓柱玻璃器皿中，靜置1 h，沉淀分為3層，取中間層（淀粉），加去離子水，并用質(zhì)量分數(shù)0.1%HCl溶液中和，離心（5 000 r/min，5 min），去上清液，沉淀淀粉用去離子水洗3遍，于40℃熱風干燥箱中干燥3 d，過100目篩后，在盛有飽和氯化鈉水溶液的密閉容器中平衡1周備用。

1.2.3 淀粉顆粒形態(tài)測定 在室溫下，將原淀粉分別固定在樣品臺上，鍍金（10 nm），抽真空后在5.0 kV加速電壓下用掃描電鏡觀察，并拍下掃描圖片，測定淀粉顆粒粒徑分布[8-9]。

1.2.4 淀粉晶體結(jié)構(gòu)測定 分別稱取0.5 g淀粉制成平整平面樣品試片[10]。測試條件為：加速電壓40 kV，電流 30 mA，掃描范圍（2θ）為 3°～45°，掃描速度為 2°/min，步長 0.02°，實驗重復(fù) 3 次，用 MDI Jade 5.0軟件進行結(jié)果分析。

1.2.5 淀粉分子結(jié)構(gòu)測定 側(cè)鏈分布測定參照Guodong Liu等人方法[11]。50 mg原淀粉加入10 mL醋酸鈉緩沖液（0.01 mol/L，pH 3.5），然后在沸水浴中加熱30 min，冷卻到37℃，取2 mL淀粉溶液于5 mL離心管中并加入100 μL稀釋后的異淀粉酶（100 U/mL），震蕩保溫24 h后，沸水浴5 min滅活，離心（5 000 r/min，10 min），取出0.5 mL 上清液加入4.5 mL去離子水，過0.45 μm水相濾膜，注入高效陰離子交換色譜系統(tǒng)（HPAEC-PAD）。測定條件：色譜柱 CarboPac PA200，柱溫 25 ℃，進樣量 25 μL；流動相A為150 mmol/L NaOH溶液，流動相B為含500 mmol/L NaAC 的 NaOH（150 mmol/L）溶液；流量1 mL/min，洗脫條件參照許晶晶等人的方法[12]。

相對分子質(zhì)量測定參照Song-Ho Yoo等人的方法[13]。分別將樣品溶解于體積分數(shù)90%DMSO溶液中，沸水浴1 h，冷卻后加5倍體積的無水乙醇靜置 1 h，離心（5 000 r/min，5 min），用乙醇洗滌 3 次后烘干。制備樣品溶液，于沸水浴中加熱1 h，使樣品充分分散溶解，然后過0.45 μm水相濾膜，注入HPSEC-MALLS-RI系統(tǒng)中。測定條件：樣品測定前，系統(tǒng)經(jīng)葡聚糖標準系列物校正；串聯(lián)色譜柱為OHpak SB-806 HQ，OHpak SB-804 HQ；流動相為含有質(zhì)量分數(shù)0.02%NaN3的NaNO3溶液，流量0.6 mL/min，柱溫55℃；多角度激光光散射儀的光源波長為623.8 nm。用系統(tǒng)自帶的Astra軟件分析所得實驗數(shù)據(jù)，并采用兩階多項式Berry方程擬合得出淀粉相對分子質(zhì)量分布。

2 結(jié)果分析

2.1 灌漿期糯米顆粒形貌分析

由圖1可見，不同灌漿天數(shù)的糯米淀粉顆粒大多數(shù)呈多邊形，且粒徑多分布在5～8 μm范圍。淀粉顆粒呈現(xiàn)出一些凹坑，這是由于淀粉經(jīng)堿液處理，蛋白質(zhì)從淀粉表面剝離時，造成結(jié)構(gòu)破損，導(dǎo)致顆粒表面出現(xiàn)凹坑[14]。在灌漿初期可以看到有少量的小球體狀，即含有未成熟淀粉顆粒的淀粉體。隨著灌漿天數(shù)的增加，這種顆粒漸漸變大并裂變成多邊體的顆粒。灌漿第35 d，稻谷成熟時，這種球狀體淀粉顆粒轉(zhuǎn)化成為成熟的多邊體淀粉顆粒并消失。

圖1 不同灌漿天數(shù)糯米淀粉掃描電鏡圖Fig.1 SEM of waxy rice starches from seeds harvested at different pollination stage

從圖2可知，在灌漿期間，整體淀粉顆粒峰值粒徑在不斷增大，從5.92 μm 增大到6.77 μm。 反映了淀粉中未成熟淀粉顆粒粒徑不斷增加。在灌漿前期，有關(guān)淀粉合成的酶活性較高，淀粉積累比較快速，使粒徑增長比較快。在灌漿后期大部分淀粉顆粒成熟，且主要淀粉合成酶酶活極低，使淀粉粒徑維持在6.7 μm左右。

圖2 不同灌漿天數(shù)糯米淀粉顆粒粒徑分布Fig.2 Particle diameter distribution of waxy rice starches at different pollination stage

2.2 晶體特性分析

淀粉在合成過程中，支鏈淀粉的非還原端與顆粒表面垂直，由內(nèi)到外，呈放射狀排列分子鏈之間通過氫鍵締結(jié)，形成晶體層和無定形層交替的半晶體結(jié)構(gòu)[15]。其中晶體層由側(cè)鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)緊密排列而成；無定形層主要包括松散分支點與直鏈淀粉[16]。在淀粉合成過程中，側(cè)鏈都有一定的長度要求。并影響分支簇結(jié)構(gòu)的形成，同時造成了淀粉粒晶體結(jié)構(gòu)的差異。如圖3所示，不同灌漿天數(shù)糯米淀粉的 X-衍射圖， 樣品的 2θ 角為 15.2°、18.5°、18.2°、23.2°。顯示較強的衍射峰，為A型結(jié)晶峰，與先前報道一致[17]。但不同樣品間晶體結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在X衍射圖譜出峰之間的相對強度上，比如灌漿22和27 d 樣品在 2θ=18.2°峰強度比 2θ=17.5°高， 而灌漿13 d淀粉則相反。說明在灌漿期淀粉的晶型不發(fā)生改變，但淀粉結(jié)晶區(qū)內(nèi)的α-1，6糖苷鍵上的葡萄糖基間的夾角可能發(fā)生了變化[18]。說明在灌漿期間糯米淀粉微晶排列或者結(jié)晶區(qū)的晶胞結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。淀粉的結(jié)晶度也受支鏈淀粉側(cè)鏈長短的影響[19]。在2θ角為20°附近沒有衍射峰出現(xiàn)，表明淀粉中幾乎不含淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物晶體。

圖3 不同灌漿天數(shù)糯米淀粉的X-衍射圖Fig.3 X-ray diffraction patterns of waxy rice starches from seeds harvested at different pollination stage

圖4 不同灌漿天數(shù)的糯米淀粉側(cè)鏈分布變化Fig.4 Unit chain distribution of debranched amylopectins isolated from waxy rice starches at different pollination stage

圖3中相對結(jié)晶度的大小表征了淀粉中晶體的含量。從灌漿11～35 d，糯米淀粉的結(jié)晶度從31.0%增加到37.5%，說明了反映了晶體含量在不斷增加，從而使灌漿期間淀粉顆粒的結(jié)構(gòu)越來越堅固。

2.3 淀粉分子結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 淀粉側(cè)鏈分析 根據(jù)Liu G報道[11]，不同聚合度側(cè)鏈劃分：A 鏈，DP 6～12；B1 鏈，DP 13～24；B2鏈，DP 25～36；B3 鏈，DP≥37。 在淀粉顆粒成長過程中，各種有關(guān)淀粉合成酶的變化一直在變化，導(dǎo)致淀粉顆粒內(nèi)外部側(cè)鏈比例以及相對分子質(zhì)量存在差異，糯米淀粉顆粒粒徑分布的變化必然引起分子結(jié)構(gòu)的變化。由圖4可見，在整個灌漿期間A鏈結(jié)晶度整體表現(xiàn)為先略下降再增加的趨勢，B1鏈結(jié)晶度整體為下降態(tài)勢。B2鏈結(jié)晶度基本在11.21%～12.85%范圍內(nèi)，變化比較小。其中A和B1鏈占淀粉側(cè)比較大的比例，并形成雙螺旋進而形成結(jié)晶。它們的變化趨勢與淀粉相對結(jié)晶度變化不一致，但對微晶的排列和晶體的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，反映了在灌漿期側(cè)鏈變化不足以對淀粉結(jié)晶度產(chǎn)生影響，說明其結(jié)晶的增加是由其他無定形的轉(zhuǎn)變而來。鏈B3所占比例較小，在灌漿前期略有增加，在灌漿后期減少到4.25%，在后期，短鏈增加使長鏈含量減少。2.3.2 淀粉分子特性分析 在食品中，淀粉多處于水環(huán)境中，用水溶液作溶解液和流動相得出的研究結(jié)果更能反映淀粉在水環(huán)境中真實的狀態(tài)。

由表1可以看出，在灌漿期間，旋轉(zhuǎn)半徑（Rw）則在153.3～207.6 nm之間，在灌漿后期變大，與重均相對分子質(zhì)量（Mw）變化一致。重均相對分子質(zhì)量（Mw） 從灌漿 11 d 的 6.817×107， 到灌漿 17 d 為5.905×107，然后灌漿 27 d淀粉的相對分子質(zhì)量1.696×108最大。糯米淀粉的數(shù)均相對分子質(zhì)量（Mn）變化范圍從 4.924×107～1.428×108。Z 均相對分子質(zhì)量（Mz）在 4.634×107～1.800×108范圍內(nèi)。整體來看，灌漿后期淀粉的Mw和Mn比前期大，說明了具有高密度側(cè)鏈的大分子淀粉含量增加。

表1 不同灌漿時間糯米淀粉分子特性Table 1 Molecular characterization of waxy rice starches at different pollination stage

2.3.3 淀粉分子構(gòu)象分析 淀粉大分子在水溶液中重均相對分子質(zhì)量與均方根半徑（RMS）的關(guān)系，可以用公式表示：RMS=KMγ表示。RMS隨著Mw的增大而增大。指數(shù)γ可表征溶液中大分子不同的構(gòu)象。γ為0.33時，大分子為球狀構(gòu)象，γ為0.5-0.6時為無規(guī)則的線團構(gòu)象。

圖5 不同灌漿天數(shù)糯米淀粉的RMS半徑對摩爾質(zhì)量圖（直線是對數(shù)據(jù)的擬合）Fig.5 Relationships of between the weight-average molecular weight （Mw） and z-averaged mean square radius（RMS）

由圖5可見，斜率即γ在0.1378～0.2164范圍內(nèi)，這是由于淀粉在水溶液中聚集導(dǎo)致的。近似水平的數(shù)據(jù)點所在的RMS代表著不同樣品的聚集體所占體積的大小。聚集特性受淀粉相對分子質(zhì)量的大小和排列的影響。 灌漿 11、13、15、17、22、27、35 d糯米淀粉聚集體的 RMS分別為 200、235、220、207、230、250、213 nm。灌漿27 d糯米淀粉具有較大聚集體，說明其在水溶液中比較容易聚集。

3 結(jié)語

1）在灌漿初期出現(xiàn)小球體狀未成熟淀粉顆粒，隨著灌漿天數(shù)的增加，顆粒峰值粒徑從5.92 μm增加到 6.77 μm。

2）從灌漿11～35 d，糯米淀粉的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化且結(jié)晶度從31.0%增加到37.5%，反映了在灌漿期間淀粉中的晶體含量在不斷增加。

3）在灌漿后期，灌漿后期淀粉的 Mw，Mn，Mz比前期較大，具有高密度側(cè)鏈的大分子淀粉分子含量增加；灌漿后期的糯米淀粉分子在水溶液比較容易聚集，且形成最大聚集體。

4）灌漿11 d糯米淀粉短鏈A、B1鏈含量較多，相對分子質(zhì)量較小，同時在水中不易聚集，可作為米糕、糯米團的原料以抑制產(chǎn)品回生；灌漿27 d糯米淀粉短鏈A、B1鏈含量較少，相對分子質(zhì)量大，容易聚集，可作為粉絲、粉條等產(chǎn)品的原料以促進產(chǎn)品回生硬化。灌漿35 d糯米顆粒最大且結(jié)晶度最大，可用來制作抗性淀粉、慢消化淀粉等產(chǎn)品的主要原料。