劉軍波， 鄒禮根， 趙 蕓

（1.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工所，浙江 杭州310024；2.農(nóng)業(yè)部果品產(chǎn)后處理重點實驗室，浙江 杭州310021）

藍 莓 （Blueberry）， 杜 鵑 科 （Ericaceae） 越 橘 屬（Vacciniumspp.）植物，原產(chǎn)地北美，自引進我國后開始在各地廣泛種植[1]。藍莓因含有豐富的花青素物質(zhì)，備受人們青睞[2]?；ㄇ嗨?，屬于類黃酮物質(zhì)，是一種廣泛存在于植物中的水溶性色素，在植物中，花青素常以與糖苷基團相結(jié)合形式存在，又稱花色苷[3]，其基本結(jié)構(gòu)中包含一個2-苯基苯并吡喃組成的C6-C3-C6母核結(jié)構(gòu)，這個母核結(jié)構(gòu)被稱為花色苷基元[4]。花青素具有顯著的抗氧化功效，能有效清除人體自由基，增強免疫力等功效[5-7]，但花青素結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易受到加工和貯藏條件，如溫度、氧氣、光照、酶活性、pH、添加劑等因素影響而降解損失[8-9]。不同植物來源的花青素因為含量和種類的區(qū)別，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也存在差異。藍莓中花青素種類超過25種，其中主要有矢車菊色素，飛燕草色素、矮牽牛色素、芍藥色素和錦葵色素及它們的糖苷結(jié)合態(tài)等組成[10]?；ㄇ嗨氐谋＝」πб呀?jīng)得到人們的廣泛認(rèn)可，因此，藍莓花青素是評價藍莓產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)[11-12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓：品種粉藍，由浙江貝萊特藍莓開發(fā)有限公司種植基地提供。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計（UV-2550）：日本島津有限公司產(chǎn)品；水分活動儀（LabMaster）：瑞士 NOVASINA公司產(chǎn)品；色差儀（Color Quest XE）：美國 HunterLab公司產(chǎn)品；分析天平：梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；恒溫水浴設(shè)備（Julabo TW8）：德國優(yōu)萊博公司產(chǎn)品；破碎勻漿機（T18）：德國IKA公司產(chǎn)品；超聲提取設(shè)備（KQ-500）：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 藍莓花青素溶液的制備 將藍莓和水按照料液質(zhì)量體積比1 g∶10 mL破碎打漿后，500 W功率超聲提取20 min后，以4 000 r/min離心10 min，將上清液或稀釋液作為藍莓花青素溶液進行穩(wěn)定性試驗。

1.3.2 藍莓花青素光譜吸收特性 將藍莓花青素溶液在380～780 nm可見光波長范圍內(nèi)進行光譜吸收強度掃描，繪制藍莓花青素的光譜吸收曲線。

1.3.3 pH、光照、溫度對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響利用氯化鉀-鹽酸和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)藍莓花青素溶液 pH 為 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，研究pH對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響。在室溫（25 ℃）、40、60、80、100 ℃下，研究溫度對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響。在光照和避光貯藏條件下，對比研究光照對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 金屬離子對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響 對照空白，在10 mmol/L添加濃度下50℃處理4 h，研究 Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+等金屬離子對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.5 外源添加物對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響與空白對照，通過選取典型的甜味劑蔗糖、防腐劑山梨酸鉀、酸度調(diào)節(jié)劑檸檬酸鈉、抗氧化劑抗壞血酸和茶多酚等外源添加物，50℃處理4 h，研究外源添加物對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響。

1.3.6 穩(wěn)定性指標(biāo)測定方法 吸收強度：在光譜吸收曲線中，吸收峰值對應(yīng)波長下的吸收值。

色澤的測定：利用色差儀在透射模式下測定溶液的 L*、a*、b*值，其中 L*值代表亮度，L*值越大，代表亮度越高；a*值代表紅綠色度，a*值越大，則說明紅色度越深，a*值越小代表綠色度越深；b*代表黃藍色度，b*值越大，則說明黃色度越深，b*值越小，代表藍色度越深。

花青素質(zhì)量濃度的測定：利用pH示差法[13]，取0.5 mL測試液兩份，分別加入9.5 mL pH 1.0和 pH 4.5緩沖液，在暗處平衡30 min，以蒸餾水作對照，在510 nm和700 nm分別測定其吸光值A(chǔ)，花青素質(zhì)量濃度的計算公式如下：

式中：X為花青素質(zhì)量濃度，mg/L；A510為510 nm波長下的吸光值；A700為700 nm波長下的吸光值；L為比色皿的寬度，cm；ε為藍莓中主要的花青素物質(zhì)矢車菊-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)26 900；MW為矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量449.2；n為稀釋倍數(shù)。

花青素保存率：按下面公式計算

式中：V為花青素保存率，%；Xi為各試驗組花青素質(zhì)量濃度；X0為對照組花青素質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)平行測定3次，利用DPS軟件進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓花青素光譜吸收特性

將藍莓花青素溶液適當(dāng)稀釋至吸收值在1.0以下，在可見光波長380～780 nm范圍內(nèi)全波段掃描吸收強度，繪制藍莓花青素溶液的吸收光譜曲線，如圖1所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藍莓花青素在518 nm處有最大吸收峰，這與宋德群等的研究結(jié)果最大吸收峰在520 nm[14]稍有偏差，可能不同產(chǎn)地和品種的藍莓花青素種類不同導(dǎo)致吸收特性稍有區(qū)別。因此，藍莓花青素溶液吸收強度的測定波長確定在518 nm。

圖1 藍莓花青素吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectrum of blueberry anthocyanin

2.2 藍莓花青素穩(wěn)定性

2.2.1 pH對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響 藍莓花青素在不同pH溶液下的吸收強度如圖2所示，pH對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響比較大，在pH 1.0～6.0范圍內(nèi)，隨pH增大，吸收強度逐漸減弱，而pH 7.0后吸收強度又開始稍有回升，其中pH 1.0吸收強度最大。在溶液中藍莓花青素存在4種分子結(jié)構(gòu)：紅色的黃烊鹽陽離子，無色的假堿和查耳酮，藍色的醌型堿。這4種結(jié)構(gòu)之間存在黃烊鹽陽離子和假堿之間的水合平衡反應(yīng)，黃烊鹽陽離子和醌型堿之間的酸堿平衡反應(yīng)，假堿和查爾酮之間的環(huán)鏈異構(gòu)化平衡反應(yīng)[15]。由表1可知，在酸性溶液中，pH越低，黃烊鹽陽離子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，溶液顯現(xiàn)紅色[16]，紅色度a*值越大，而隨著pH增大，黃烊鹽陽離子分子結(jié)構(gòu)向無色的假堿或查爾酮轉(zhuǎn)化，溶液a*值降低，紅色度減弱，當(dāng)pH＞7.0后，分子結(jié)構(gòu)中繼續(xù)失去H+，逐漸向藍色的醌型堿轉(zhuǎn)變，b*值減小，向藍色度轉(zhuǎn)移，而藍色度的增加一定程度上又會促使可見光吸收強度升高。由圖2和表1中不同pH下藍莓花青素的吸收強度和色度a*值比較，在pH＜3的酸性環(huán)境下，藍莓花青素相對比較穩(wěn)定。

圖2 不同pH值條件下藍莓花青素的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of blueberry anthocyanin under different pH

表1 pH對藍莓花青素色澤的影響Table 1 Effect of pH on blueberry anthocyanin color

2.2.2 光照對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響 光照和避光貯藏對比試驗如圖3所示，兩種貯藏方式下，藍莓花青素保存率均有不同程度的減少，但相對于光照貯藏，在避光貯藏過程中藍莓花青素降解相對緩慢，貯藏10 d后，在避光條件下藍莓花青素保存率50.9%，遠遠高于光照貯藏后的保存率25.5%。同時由表2可知，光照貯藏1 d后，藍莓花青素溶液中反應(yīng)紅色度的a*值下降很快，而避光貯藏下，a*值變化相對緩慢，這也進一步說明光照會促進藍莓花青素的降解，加快降解速率，因此，避光保存能更好地保護藍莓花青素的穩(wěn)定性。

圖3 光照對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of light on the stability of blueberry anthocyanin

2.2.3 溫度對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響 溫度對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響如圖4所示，不同溫度處理下藍莓花青素都有不同程度的降解損失，但低于60℃時，降解速率相對緩慢，當(dāng)高于60℃后，隨著溫度的升高，降解速率顯著加快，這與Araujodíaz等[17]在藍莓果汁噴霧干燥過程中對溫度影響藍莓花青素穩(wěn)定性的研究結(jié)果基本一致，當(dāng)100℃，處理4 h后，藍莓花青素的保存率僅為10.29%。高溫會加快藍莓花青素生化反應(yīng)的進行，促使紅色的黃烊鹽陽離子向無色的假堿或查爾酮方向轉(zhuǎn)化，并且高溫破壞了反應(yīng)的可逆性，導(dǎo)致花青素進一步降解，褪色[18]。

2.2.4 金屬離子對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響 當(dāng)花青素分子結(jié)構(gòu)中存在一個以上自由的羥基時，易與金屬離子發(fā)生絡(luò)合，金屬離子與花青素絡(luò)合后可能產(chǎn)生“增色”或“褪色”效應(yīng)[19]，這具體取決于溶液體系中金屬離子和花青素的種類[20]。由圖5可知，在 10 mmol/L 濃度下，Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+都增加了藍莓花青素的吸收強度，并且，由表3可知，同時色度a*值都顯著增高（P＜0.05），具有不同程度的增色效應(yīng)。而Fe3+和Cu2+的添加，吸收強度不但沒有增加，反而下降，色度值a*也發(fā)生了下降，這說明Fe3+和Cu2+的添加，不但沒有起到穩(wěn)定效果，而且產(chǎn)生了褪色效應(yīng)，當(dāng)然這可能與Fe3+和Cu2+兩種金屬離子自身分別顯黃色和藍色也有一定關(guān)系。因此，在藍莓產(chǎn)品加工過程中，要考慮金屬離子的引入種類和食用安全性，通過金屬離子與藍莓花青素分子絡(luò)合，以更好地保護藍莓花青素的穩(wěn)定性。

表2 光照對藍莓花青素色澤的影響Table 2 Effect of light on blueberry anthocyanin color

圖4 溫度對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the stability of blueberry anthocyanin

表3 金屬離子對藍莓花青素溶液色澤的影響Table 3 Effect of metal ions on the blueberry anthocyanin color

2.2.5 外源添加物對藍莓花青素的影響 在果蔬產(chǎn)品加工過程中常常不可避免地要引入甜味劑、防腐劑、酸度調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑等外源添加物，這些物質(zhì)對花青素穩(wěn)定性的影響，也是不可忽視的影響因素[21]。研究了不同添加濃度下對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響。由圖6（a）和表4可知，蔗糖在質(zhì)量濃度低于50 g/L時，對藍莓花青素吸收強度的影響，并沒有統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異（P＞0.05），而對色度a*值的影響也比較小，但質(zhì)量濃度在高于50 g/L后，吸收強度和a*值都有小幅度升高，與對照組有顯著性差異（P＜0.05）。 圖 6（b）和表 5 可知，在 0.01～0.08 g/L 山梨酸鉀添加質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，無論吸收強度和色度a*值都沒有顯著性差異（P＞0.05）。 由圖 6（c）和表 6可知，在0.25～2.00 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，檸檬酸鈉的添加效果卻整體低于對照組，吸收強度和色度a*值均有所下降，反而對藍莓花青素的穩(wěn)定性構(gòu)成破壞作用，這可能因為檸檬酸鈉是一種強堿弱酸鹽，它的加入會改變?nèi)芤旱膒H，致使花青素降解損失；而在同樣質(zhì)量濃度下抗壞血酸和茶多酚添加后，藍莓花青素溶液吸收強度明顯升高，它們藍莓花青素穩(wěn)定性具有顯著提升效果?？箟难嶙鳛槌Ｓ玫目寡趸瘎?，能與溶液中的一些自由基團優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)，從而減輕了這些基團對藍莓花青素的破壞，對藍莓花青素穩(wěn)定性起到保護作用，且由表6可知，a*值顯著增大，色度向紅色加深，說明抗壞血酸的添加具有顯著的增色效應(yīng)[22]；茶多酚與花青素同屬類黃酮物質(zhì)，都具有π平面電子結(jié)構(gòu)，可以與花青素分子結(jié)構(gòu)相互疊加，以π鍵共價結(jié)合的方式，形成疏水力，穩(wěn)定花青素結(jié)構(gòu)[23]，而且，茶多酚的添加，使藍莓花青素溶液吸收峰值對應(yīng)的波長由518 nm外移至527 nm，這也進一步說明，茶多酚與藍莓花青素分子間π鍵共軛效應(yīng)發(fā)揮了輔助發(fā)色作用。

圖6 外源添加物對藍莓花青素穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of Exogenous Additives on stability of Anthocyanins of Blueberry

3 結(jié) 語

pH對藍莓花青素穩(wěn)定性影響顯著，其中pH＜3.0的酸性環(huán)境下藍莓花青素相對比較穩(wěn)定；高溫對藍莓花青素穩(wěn)定性破壞作用大，溫度越高，藍莓花青素降解速率越快，而當(dāng)溫度小于60℃時，對藍莓花青素穩(wěn)定性影響相對較??；光照會加快藍莓花青素的降解速率。

在 10 mmol/L 金屬離子濃度下，Na+、K+、Zn2+、Ca2+、Mg2+均能不同程度提高藍莓花青素的穩(wěn)定性，并具有增色效應(yīng)；而Fe3+和Cu2+的添加，穩(wěn)定性不但沒有增加，反而下降。

表4 蔗糖對藍莓花青素色澤的影響Table 4 Effects of sucrose on Blueberry anthocyanin color

表5 山梨酸鉀對藍莓花青素色澤的影響Table 5 Effect of potassium sorbate on Blueberry anthocyanin color

表6 檸檬酸鈉、抗壞血酸、茶多酚對藍莓花青素色澤的影響Table 6 Effect of sodium citrate，ascorbic acid，tea polyphenols on Blueberry anthocyanin color

蔗糖當(dāng)添加質(zhì)量濃度低于50 g/L時對藍莓花青素穩(wěn)定性影響不顯著，但高質(zhì)量濃度蔗糖對藍莓花青素穩(wěn)定性有一定的保護作用；在0.01～0.08 g/L添加質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，山梨酸鉀對藍莓花青素穩(wěn)定性影響不明顯；0.25～2.00 g/L添加范圍內(nèi)，檸檬酸鈉反而降低了藍莓花青素的穩(wěn)定性，而在同樣質(zhì)量濃度下，抗壞血酸和茶多酚卻能顯著提高藍莓花青素穩(wěn)定性，并且具有輔色效應(yīng)。