馮美琴，劉雯燕，孫 健,*，徐幸蓮，周光宏

（1.金陵科技學院動物科學與技術(shù)學院，江蘇 南京 210038；2.南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095）

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）作為肌肉中的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)群，除了影響肌肉的收縮及嫩度外，它也是參與乳化的主要物質(zhì)，并且其受熱形成的凝膠對乳化肉制品的質(zhì)構(gòu)、黏著性、保油保水性和出品率有直接的影響[1]。因此，MP在重組肉制品和糜類肉制品加工過程中起著重要作用[2]。另外，MP乳化凝膠作用受其理化性質(zhì)的影響，例如肌肉類型、蛋白質(zhì)濃度、溫度、pH值和離子強度，同時受其他添加物的影響。其中，食鹽是肉類加工過程中必需的輔料之一[3-4]，它可以改善肉制品的保水保油能力，產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)以及感官品質(zhì)[5]。Whiting[6]研究發(fā)現(xiàn)在法蘭克福香腸中降低NaCl含量可以增加脂肪和水在蒸煮過程中的損失。吳菊清[7]研究發(fā)現(xiàn)低鹽條件會影響MP乳化物及乳化凝膠的水分分布，降低凝膠保水性。據(jù)報道[8]食鹽的過多攝入會影響人類健康。因此在實際生產(chǎn)中，常常通過添加亞麻籽膠（f l axseed gum，F(xiàn)G）等親水膠體改善低鹽條件下造成的肉制品品質(zhì)劣變。

FG是從亞麻籽中提取的一種陰離子多糖，具有良好的膠凝、發(fā)泡、乳化、保水和流變特性。Chen Haihua等[9]研究FG與肉蛋白間相互作用，發(fā)現(xiàn)添加FG能夠顯著提高蛋白質(zhì)的熱變性溫度，并且增加保水性和硬度。孫健[10]研究發(fā)現(xiàn)添加FG的豬肉MP凝膠結(jié)構(gòu)變得更加致密連續(xù)。Feng Meiqin等[11]研究發(fā)現(xiàn)MP的保水性隨著FG的添加量的提高而增強。MP熱誘導凝膠的功能特性（比如凝膠保水性）主要取決于化學作用力[12]。目前報道主要集中于單一理化條件下對MP的影響，本實驗創(chuàng)新性地通過在不同NaCl濃度條件下加入FG研究其能否提高低濃度NaCl條件下的乳化凝膠特性。另外，以豬油為油相模擬簡單的肉糜體系研究FG-MP的乳化作用也鮮見報道。

本實驗在不同NaCl濃度條件下，研究FG-M凝膠的作用力（離子鍵、氫鍵、疏水相互作用、二硫鍵和非二硫鍵）和FG-MP凝膠的作用機理，同時以豬油為油相研究FG-MP乳液的乳析指數(shù)、脂肪微粒粒度分布、ζ-電位以及顯微觀察研究NaCl濃度對FG-MP乳化體系穩(wěn)定性的影響，從而確定FG對MP乳化凝膠的作用機制，促進FG在肉制品中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宰后24 h（pH 5.6～5.8）的豬肉背最長肌，購于南京蘇果超市；豬背膘熬制，用紗布過濾得到豬油，真空包裝，置于-20 ℃保存。

FG（純度99.8%，含有16.09%蛋白質(zhì)、5.10%水和4.35%灰分） 新疆綠旗公司；氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、Triton X-100、酒石酸鉀鈉、磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉、甲醇、十二烷基硫酸鈉、尿素、碳酸鈉、硫酸銅等均為分析純。

1.2 儀器與設備

Ultra-Turrax T25 basic數(shù)顯型高速分散機 德國IKA公司；AR64型高速冷凍離心機 美國Beckman-Coulter公司；M2e多功能酶標儀 美國MD公司；AUY120型天平 日本島津公司；Worcestershire激光粒度分析儀、Nano ZS90電位儀 英國Malvern公司；DP12倒置顯微鏡日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參照Han Minyi等[13]的方法并進行改進。稱取100 g肉，用絞肉機攪碎后，加入400 mL pH值為7.0提取液（其中含20 mmol/L K2HPO4-KH2PO4、100 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L乙二醇二乙醚二胺四乙酸）于1 000×g離心10 min后收集沉淀，重復2 次，期間用勻漿機處理30 s。然后向離心后的沉淀中加入400 mL提取液，再加入4 mL Triton X-100，充分混勻后1 500×g離心10 min，再向沉淀中加入400 mL 0.1 mol/L KCl溶液，1 500×g離心10 min收集沉淀，重復2 次。最后沉淀加入400 mL去離子水，1 500×g離心10 min收集沉淀，重復2 次。由以上操作得到無鹽的MP，用雙縮脲法測其蛋白質(zhì)量濃度，密封置于4 ℃保存?zhèn)溆?。上述過程均在4 ℃條件下進行。

將提取的蛋白分別溶于含有不同濃度的NaCl（0、0.2、0.4、0.6 mol/L）的磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4，pH 6.5）中，根據(jù)實驗要求配制相應濃度的MP溶液，置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 FG-MP凝膠的制備

將FG與豬肉MP用勻漿機混合均勻，使MP最終質(zhì)量濃度為40 mg/mL，加入質(zhì)量分數(shù)0.4% FG。將配好的樣品放入水浴鍋，以約1 ℃/min的速率從20 ℃升溫到70 ℃，保溫30 min。冷卻后測定相關(guān)指標。

1.3.3 FG-MP復合凝膠體系分子間相互作用力測定

有軌電車聯(lián)通線類似于地鐵聯(lián)絡線，但又不同于地鐵聯(lián)絡線。有軌電車要實現(xiàn)網(wǎng)絡化運營，需在聯(lián)通運營的線路之間設置聯(lián)通線。聯(lián)通線宜采用互通道岔連接，由于多條線路在此交匯運營，在一定行車密度下不同運營線路的車輛可能同時到達，因此，接軌站站位和配線的設計應結(jié)合信號控制需求，以保障車輛不會由于排隊而影響交叉口的正常通行為準則。

參照蘭冬梅[14]的方法，稱取凝膠樣品3 g，加S1（0.6 mol/L NaCl，30 mL），用5 000 r/min勻漿2 min，然后放置1 h，10 000×g離心25 min后上清液保存。離心后的沉淀加S2（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素，30 mL），重復上述步驟，將沉淀繼續(xù)加S3（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素，30 mL），重復上述步驟，向沉淀加S4（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+0.5 mol/L β-巰基乙醇，30 mL），重復上述步驟，最后所得的沉淀加2 mL 1 mol/L NaOH溶液保存。并且所得的所有上清液分別加入相同體積的20%三氯乙酸溶液，5 500×g離心15 min，取其沉淀，向沉淀中加入2 mL 1 mol/L NaOH溶液保存，然后用Lowry法測定蛋白質(zhì)的含量。上述過程均在4 ℃條件下進行。其中，S1蛋白含量代表離子鍵，S2蛋白含量代表氫鍵，S3蛋白含量代表疏水相互作用，S4蛋白含量代表二硫鍵，S4離心后沉淀的蛋白含量代表非二硫共價鍵。

1.3.4 乳化液的制備

FG添加量是依據(jù)前期研究結(jié)果[15]所得，研究發(fā)現(xiàn)添加質(zhì)量分數(shù)0.4% FG條件下，乳液能夠保持相對穩(wěn)定，并且在低離子強度（0、0.2 mol/L NaCl）條件下沒有發(fā)生乳析現(xiàn)象。

將質(zhì)量分數(shù)0.4% FG溶解于0、0.2、0.4、0.6 mol/L不同濃度NaCl的MP溶液中，使MP最終質(zhì)量濃度為10 mg/mL。再分別將含有FG和不含F(xiàn)G的MP溶液中加入10%豬油，8 000×g勻漿制成乳狀液。上述過程均在40 ℃條件下進行。準備的乳化液要在24 h之內(nèi)使用。

1.3.5 乳化穩(wěn)定性的測定

將待測樣品置于玻璃試管（1.0 cm×15 cm）中，在常溫條件下靜置3 h及30 d記錄乳析界面高度的變化。乳析指數(shù)按下式計算：

式中：Hs為清液的高度/cm；Ht為乳化液的初始高度/cm。

1.3.6 ζ-電位的測定

1.3.7 脂肪微粒粒度分布測定

參考Ahmed等[16]的方法并進行修改。其中，顆粒折射率為1.520，分散劑為水，分散折射率為1.330，顆粒吸收率為0.001，分析模式為通用球形，進樣器名為Hydro 2000 MU(A)，噪音為30 s。采用Mastersizer 3000型激光粒度分析儀進行測定，得到脂肪微粒粒度分布圖譜。數(shù)據(jù)結(jié)果用平均粒徑D4,3表示。

1.3.8 光學顯微鏡

乳液的微結(jié)構(gòu)研究使用光學顯微鏡觀察。將乳液滴到載玻片上并用蓋玻片覆蓋。使用顯微鏡數(shù)字照相機（OlympusDP12，Tokyo，Japan）連接到軟件（Olympus DP12，Tokyo，日本）安裝在計算機上。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗重復3 次，采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件計算。采用Duncan’s multiple range test程序分析平均值和差異，并在顯著性水平P值小于0.05時進行單因素方差分析和t檢驗，評估樣本組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度條件下FG對MP凝膠體系分子間相互作用力的影響

圖1 不同NaCl濃度條件下FG對MP凝膠體系分子間相互作用力的影響Fig. 1 Effects of different NaCl concentrations and FG on the chemical interactions of MP gel

如圖1所示，MP凝膠中疏水相互作用、二硫鍵以及非二硫共價鍵所占的比例較大，而離子鍵和氫鍵所占比例較小。蘭冬梅[14]在研究羅非魚肌肉蛋白凝膠過程中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。隨著NaCl濃度的提高，可以看出二硫鍵和非二硫共價鍵的含量是隨之升高的（P＜0.05）。并且當NaCl濃度達到0.6 mol/L時，在不含F(xiàn)G的MP凝膠中二硫鍵含量是最高的。關(guān)于疏水相互作用，不含F(xiàn)G的MP凝膠出現(xiàn)了先升高后降低的現(xiàn)象，在0.2 mol/L NaCl條件下達到最大。而在實驗范圍內(nèi)，離子鍵和氫鍵的含量無顯著變化（P＞0.05）。另外，相對于對照組，F(xiàn)G-MP凝膠的作用力隨著NaCl濃度的變化相對平穩(wěn)。

研究FG和MP間的化學作用力可以對FG在肉制品的應用具有更好的指導作用。隨著MP凝膠的形成，MP分子開始變性并有序聚集，形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而最終體系中蛋白分子的相互作用力會達到一種新的平衡狀態(tài)[17-18]。其中，蛋白分子間的相互作用力主要包括離子鍵、氫鍵、二硫鍵、疏水相互作用、非二硫共價鍵等[19]。在凝膠形成的前期，離子鍵和氫鍵開始斷裂，蛋白變性，疏

水基團和活性巰基開始外露[20]。在熱處理過程中，疏水基團和活性巰基逐漸從分子內(nèi)部暴露，體系產(chǎn)生疏水相互作用，造成肌球蛋白分子聚集[21]。而此時活性巰基發(fā)生氧化或—SH/S—S交換反應[22]，形成二硫鍵。與此同時，非二硫共價鍵也開始形成[23]，最終形成凝膠的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。隨著NaCl濃度的提高，二硫鍵和非二硫共價鍵的含量隨之升高（P＜0.05），這主要與MP的鹽溶性有關(guān)。從圖1可以看出，MP凝膠中疏水相互作用、二硫鍵以及非二硫共價鍵所占的比例較大，而離子鍵和氫鍵所占比例較小。這說明形成凝膠體系的關(guān)鍵是二硫鍵和非二硫共價鍵的貢獻。而離子鍵與氫鍵不是維持MP凝膠及FG-MP凝膠穩(wěn)定構(gòu)象的主要化學作用力。據(jù)報道，這可能是由于在凝膠形成過程中，離子鍵和氫鍵參與肌球蛋白分子尾部的纏繞，而不參與頭部的聚集[24]。

2.2 不同NaCl濃度條件下FG對MP乳液乳析指數(shù)的影響

圖2 不同NaCl濃度條件下FG對MP乳液3 h（A）和30 d（B）乳析指數(shù)的影響Fig. 2 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the creaming index of emulsions with MP at 3 h (A) and 30 d (B)

乳析指數(shù)可以從宏觀角度表征乳液的乳化穩(wěn)定性，乳析指數(shù)越低，說明乳化液越穩(wěn)定。從圖2可以看出，MP乳液受NaCl濃度的影響顯著（P＜0.05），并且隨著NaCl濃度的提高，乳析指數(shù)顯著降低，乳液更加穩(wěn)定。如圖2A所示，NaCl濃度為0、0.4、0.6 mol/L時，乳析指數(shù)為56%、18.67%、16.67%。這可能是由于鹽離子增大了MP的溶解度，使MP更好地包裹在油滴表面，從而提高了乳化穩(wěn)定性[25]。賈娜等[26]也報道了相似的現(xiàn)象，研究發(fā)現(xiàn)MP-混合食用膠乳液在低鹽條件下，隨著鹽濃度的提高，乳化穩(wěn)定性也隨著增加。值得注意的是，F(xiàn)G-MP乳液不受NaCl濃度的影響，并且在貯存期間沒有發(fā)生乳析現(xiàn)象（P＞0.05），一直保持穩(wěn)定狀態(tài)。FG添加到MP乳液后，具有乳化作用的FG包裹在油滴表面或者部分FG包裹在MP膜的表面，使油滴更加穩(wěn)定。并且據(jù)Wang Meng等[27]研究報道，F(xiàn)G還可以增強流動相的黏度，降低油分子的運動，防止其碰撞造成乳液的絮凝。另外，對比圖2A、B可以發(fā)現(xiàn)，當乳液放置30 d后，MP乳液在0.4 mol/L和0.6 mol/L NaCl條件下乳析指數(shù)明顯升高，即乳化穩(wěn)定性明顯降低。如0.2 mol/L NaCl條件下，乳液的乳析指數(shù)從48%升高至54.7%，而0.4 mol/L NaCl條件下，乳液的乳析指數(shù)從18.67%升高至43.7%。這說明高濃度NaCl條件下，MP乳液受貯藏時間影響較大。這可能是由于高濃度NaCl條件下，靜電斥力的減小使得乳化顆粒更容易聚集形成大顆粒，從而發(fā)生乳析現(xiàn)象。

2.3 不同NaCl濃度條件下FG對MP乳液ζ-電位的影響

圖3 不同NaCl濃度條件下FG對MP乳液ζ-電位的影響Fig. 3 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the zeta potential of emulsions with MP

含有10%豬油的乳化液在不同NaCl濃度條件下電位的變化，如圖3所示。在實驗范圍內(nèi)，所有乳化液都處于負電荷狀態(tài)。FG-MP乳液比MP乳液電位的絕對值更大，這可能與FG是陰離子多糖有關(guān)[28]。而MP乳液的電位值比FG-MP乳液受NaCl濃度的影響更大，這與圖1中乳析指數(shù)的結(jié)果相一致。并且對于MP乳化液，隨著NaCl濃度的提高，電位的絕對值逐漸減少（P＜0.05），在0.6 mol/L NaCl達到最小值。而對于FG-MP乳液，其電位的絕對值隨著NaCl濃度的提高略有升高（P＞0.05）。表面電位是用于評價乳化穩(wěn)定性的重要參數(shù)。電位的絕對值越大則說明油滴之間的靜電斥力越大，防止油滴聚集成大顆粒，有助于乳化液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，Na+濃度不對FG-MP乳液的穩(wěn)定性起著重要的作用（P＞0.05）。這可能是由于FG包裹在MP表面，使其受NaCl濃度的影響較小。Abdolmaleki等[29]報道了類似的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)NaCl濃度對黃蓍膠乳液穩(wěn)定性沒有顯著影響。而在MP乳化液中，MP受NaCl濃度影響較大（P＜0.05）。據(jù)悉，羧基在蛋白質(zhì)分子外圍非常活躍，創(chuàng)造一種陰離子環(huán)境[30]。隨著鹽加入到乳液中，Na+與羧基基團結(jié)合，從而導致負電荷減少。

2.4 不同NaCl濃度條件下FG對MP乳液粒徑的影響

圖4 不同NaCl濃度條件下FG對MP乳液粒徑D4,3的影響Fig. 4 Effects of different NaCl concentrations in the absence and presence of FG on the particle size (D4,3) of emulsions with MP

如圖4所示，含有FG的乳液微粒粒徑均高于不含F(xiàn)G的乳液微粒粒徑。并且含有FG的乳液微粒的粒徑隨NaCl濃度的增高略有降低，但是變化不顯著（P＞0.05），可能與多糖受NaCl影響較小有關(guān)[29]。而不含F(xiàn)G的MP乳液的粒徑受NaCl濃度的影響顯著（P＜0.05）。隨著NaCl濃度的增加，D4,3呈現(xiàn)了先減小后增大的趨勢，在0.4 mol/L NaCl條件下，顆粒粒徑達到最小值。其趨勢與前人研究結(jié)果相似[31]。這可能是因為MP的溶解度隨著NaCl濃度的提高而增大，使得更多的MP包裹在油滴表面，導致油滴粒徑的降低。但是當NaCl濃度提高到一定值，靜電斥力的降低使得油滴靠近，從而形成更大的粒徑。

2.5 MP乳液及FG-MP乳液的顯微觀察結(jié)果

圖5 MP乳液和FG-MP乳液在不同濃度NaCl條件下的微觀圖Fig. 5 Light micrographs of emulsions containing MP and FG

由圖5可以看出，豬脂肪顆粒被分散成球狀油滴分散在連續(xù)相中，并且顆粒大小與圖4結(jié)果基本一致。不含F(xiàn)G的MP乳液隨著NaCl濃度的增加，顆粒大小呈現(xiàn)了先減小后增大的趨勢，在0.4 mol/L NaCl條件下，顆粒粒徑達到最小值。含有FG的乳液微粒的粒徑隨NaCl濃度的增高，變化不明顯。并且發(fā)現(xiàn)，雖然不含F(xiàn)G的乳液粒徑小于含有FG的乳液粒徑，但是出現(xiàn)了相互聚集的趨勢。這可能與電位有關(guān)，靜電斥力減少，使得顆粒相互靠近，出現(xiàn)了聚集的現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

本實驗通過凝膠作用力的測定發(fā)現(xiàn)維持MP凝膠及FG-MP凝膠穩(wěn)定構(gòu)象的關(guān)鍵是二硫鍵和非二硫共價鍵的貢獻。另外，通過測定乳液的相關(guān)指標發(fā)現(xiàn)雖然MP乳液隨著NaCl濃度的提高，乳化穩(wěn)定性得到明顯提高，但是在高濃度NaCl條件下容易受到貯藏時間的影響。而FG-MP乳液在所有NaCl濃度范圍內(nèi)均沒有發(fā)生乳析現(xiàn)象，尤其是低濃度NaCl條件下FG-MP乳液的穩(wěn)定性顯著高于MP乳液。相對于對照組，添加FG的MP乳液的電位值和粒徑大小受NaCl濃度變化不顯著，說明FG可以抵抗NaCl濃度的變化對電位及粒徑的影響。顯微觀察發(fā)現(xiàn)FG的加入可以改善MP乳液出現(xiàn)的液滴聚集的現(xiàn)象。這說明添加FG可以顯著提高MP乳液的乳化穩(wěn)定性，并且能夠大大提高其抗鹽能力。因此，可以在實際生產(chǎn)應用中通過添加FG，改良肉制品品質(zhì)，減少食鹽攝入量，達到促進人體健康的目的，為低鹽肉制品的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。