肖鳳艷，高 磊，趙子健，欒 暢，段翠翠，趙玉娟，李盛鈺,*

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林 吉林 132109；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長春 130033）

短梗五加（Acanthopanax sessilif l orus (Rupr. et Maxim.)Seem）又名無梗五加，是五加科五加屬（Acanthopanax Miq.）植物。2008年短梗五加莖、葉、果被國家衛(wèi)計(jì)委公告批準(zhǔn)為新食品原料。短梗五加果中含有多糖、花色苷、金絲桃苷、槲皮素、原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸等成分[1]。近年來研究表明短梗五加果具有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝等多種生理功能[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)短梗五加果中提取的黃酮類化合物具有抗油脂氧化和清除羥自由基及超氧自由基的能力，并具有一定的抑菌活性[4]；短梗五加果中酚酸類成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、安眠等藥理活性[5]；短梗五加果實(shí)的正丁醇萃取部分對自由基的清除率可達(dá)到80%[6]。

研究發(fā)現(xiàn)多酚具有抗氧化、抗菌、抗血栓、抗腫瘤和抗病毒等活性[7-11]，在抗褐變、降血糖、降血壓、預(yù)防心血管疾病等方面發(fā)揮重要作用[12-16]。短梗五加果是一種富含黃酮、多酚的植物，目前國內(nèi)外對短梗五加果的研究主要集中在短梗五加果黃酮類成分鑒定以及抗氧化功能等方面，對短梗五加果多酚的提取及抗疲勞作用研究鮮見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化短梗五加果多酚的提取工藝并考察其對小鼠抗疲勞能力的影響，評價(jià)短梗五加果多酚在提高機(jī)體抗疲勞能力方面的作用，為短梗五加果多酚在功能食品中的應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

短梗五加果干品購于遼寧丹東五加高新農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司，鑒定為五加科五加屬植物短梗五加果實(shí)，挑選飽滿、干凈、干燥短梗五加果實(shí)備用。SPF級雄性ICR小鼠（6～8 周齡）80 只（SCXK（吉）-2011-0004）長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物有限公司；D101大孔吸附樹脂 天津南大樹脂科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

小鼠血清肝糖原酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒、肌糖原ELISA檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶ELISA檢測試劑盒、肌酸激酶ELISA檢測試劑盒、乳酸ELISA檢測試劑盒上海朗頓生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSZ-100型全自動收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；Sorvall Evolotion RC型高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；Cary 300紫外-可見分光光度計(jì) 美國Varian公司；ELx800型全自動酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；HZQ-Q型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FSH-II型高速電動勻漿器 上海精密儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 短梗五加果多酚提取物的制備

取3 kg短梗五加果干品，浸泡在45 L 50%乙醇溶液中，80 ℃回流提取2 次，所得提取液經(jīng)300 目濾布過濾后，減壓回收乙醇進(jìn)行凍干，得短梗五加果多酚提取物。

1.3.2 短梗五加果多酚得率的計(jì)算

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[17]

精確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)物4.50 mg置于小燒杯內(nèi)加適量甲醇超聲溶解后，定容25 mL制成標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（0.18 mg/mL）。精密吸取8、6、4、2、1 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲備液分別加入25 mL容量瓶內(nèi)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液1.0 mL，靜置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，充分混勻，靜置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液8.0 mL，靜置15 min；最后加入蒸餾水定容至25 mL，充分混勻，即為質(zhì)量濃度分別為0.057 6、0.043 2、0.028 8、0.014 4、0.007 2 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。于520 nm波長處測定各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y＝17.995X+0.004 1（R2＝0.999 6）。

1.3.2.2 短梗五加果多酚得率的測定

精確稱取短梗五加果多酚提取物12.50 mg，用甲醇定容至25 mL，得短梗五加果多酚提取液。再準(zhǔn)確量取短梗五加果多酚提取液12.5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaNO2溶液1.0 mL，靜置6 min；再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% Al(NO3)3溶液1.0 mL，充分混勻，靜置6 min；再加入4% NaOH溶液8.0 mL，靜置15 min，最后加入蒸餾水定容至25 mL，充分混勻，配制成待測樣品液。于520 nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算短梗五加果多酚提取物中多酚的含量，并以多酚得率表示。短梗五加果多酚得率計(jì)算見式（1）：

式中：C為短梗五加果提取液中多酚質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液總體積/mL；F為稀釋倍數(shù)；m1為實(shí)驗(yàn)所取短梗五加果多酚提取物質(zhì)量/mg；m2為短梗五加果多酚提取物總質(zhì)量/mg；M為短梗五加果干品總質(zhì)量/mg。

1.3.3 單因素試驗(yàn)[18]

采用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液、提取溫度80 ℃，提取次數(shù)分別為1、2、3、4，研究提取次數(shù)對短梗五加果多酚提取率的影響；提取時(shí)間分別為20、40、60、80 min，研究提取時(shí)間對短梗五加果多酚提取率的影響；液料比分別為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g），研究液料比對短梗五加果多酚得率的影響。

1.3.4 正交試驗(yàn)[19]

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取液料比、提取次數(shù)、提取時(shí)間，分別設(shè)計(jì)3 個(gè)水平，以短梗五加果為原料進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，確定短梗五加果多酚提取的最佳工藝條件。因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal array design

1.3.5 短梗五加果多酚體內(nèi)抗疲勞作用

1.3.5.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

實(shí)驗(yàn)室溫度（2 3±2）℃，1 2 h光照/黑暗循環(huán)，自由飲食攝水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。將80 只實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4 組，每組20 只：空白對照組（灌胃生理鹽水1 2 m L/（k g·d））；模型組（灌胃生理鹽水1 2 m L/（k g·d））；低劑量組（灌胃短梗五加果多酚100 mg/（kg·d））；高劑量組（灌胃短梗五加果多酚200 mg/（kg·d）），連續(xù)灌胃15 d。

1.3.5.2 負(fù)重游泳力竭時(shí)間的測定[20-22]

實(shí)驗(yàn)第15天給藥30 min后，每組隨機(jī)選取10 只小鼠（空白對照組不參與游泳實(shí)驗(yàn)），每只小鼠尾部負(fù)重5%體質(zhì)量的鉛塊，單獨(dú)放入裝有（25±2）℃水的透明塑料水桶中游泳，觀察小鼠游泳狀況并記錄小鼠游泳力竭時(shí)間，即小鼠自入水開始至完全沉入水底超過10 s的時(shí)間。

1.3.5.3 肝糖原、肌糖原、乳酸、肌酸激酶、谷胱甘肽過氧化物酶含量的測定[23-24]

實(shí)驗(yàn)第15天給藥30 min后，每組隨機(jī)選取10 只小鼠（空白對照組不參與游泳實(shí)驗(yàn)），每只小鼠尾部負(fù)重2%體質(zhì)量的鉛塊，負(fù)重游泳60 min，建立小鼠疲勞模型。游泳結(jié)束15 min后摘取小鼠眼球取血，脫頸處死，迅速解剖分離脾臟、肝臟、腎臟并稱取質(zhì)量[25]，按式（2）計(jì)算臟器指數(shù)：

血液樣品離心后收集血清，取肝組織、肌肉組織分裝，均置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。參照試劑盒說明書測定小鼠肝臟中肝糖原含量、肌肉中肌糖原含量和小鼠血清中乳酸、肌酸激酶、谷胱甘肽過氧化物酶含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

正交試驗(yàn)所得結(jié)果由SPSS 19.0軟件分析，確定因素水平的優(yōu)劣，選擇出最佳提取工藝。其余實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，均以表示，采用單因素方差分析，不同組間的比較采用方差分析比較，以P小于0.05判斷為差異顯著，P小于0.01判斷為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 短梗五加果多酚提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，隨著提取次數(shù)的增加，短梗五加果多酚得率逐漸提高，但綜合考慮提取時(shí)間和提取效率，提取次數(shù)選擇2 次；隨著提取時(shí)間的延長短梗五加果多酚得率逐漸提高，提取60 min多酚得率最高，提取時(shí)間過短多酚提取不完全，提取時(shí)間過長會增加能耗，同時(shí)多酚類物質(zhì)的穩(wěn)定性將變差，從而降低多酚得率，因此提取時(shí)間選擇60 min；隨著提取溶劑用量的增加，溶劑能夠溶解的物質(zhì)質(zhì)量在不斷增大，短梗五加果多酚得率逐漸提高，液料比為15∶1（mL/g），多酚得率為1.03%，液料比為20∶1（mL/g）多酚得率提高到1.34%，再增大提取溶劑用量，多酚得率提高并不顯著，反而會增加后續(xù)濃縮的難度和成本，綜合考慮選擇液料比20∶1（mL/g）。

圖1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 1 Effect of various factors on extraction efficiency

2.2 短梗五加果多酚提取正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2可知，3 個(gè)因素對短梗五加果多酚得率的影響順序?yàn)镃＞A＞B，即提取時(shí)間＞液料比＞提取次數(shù)。由表3可知，液料比和提取時(shí)間對短梗五加果多酚得率有顯著影響（P＜0.05）；提取次數(shù)對短梗五加果多酚得率無顯著影響（P＞0.05）。最后確定的最佳提取工藝條件為A3B2C2，即液料比20∶1（mL/g）、提取2 次、提取時(shí)間60 min。通過此最佳提取工藝條件進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，短梗五加果多酚得率為1.426%。

表3 正交試驗(yàn)主體間效應(yīng)檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance for effect of various factors on extraction efficiency

2.3 短梗五加果多酚對小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響

表4 短梗五加果多酚對實(shí)驗(yàn)小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響Table 4 Effects of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on body mass and organ indices in mice

從表4可知，實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體質(zhì)量均在27.64～28.27 g之間，低劑量組、高劑量組小鼠與模型組相比無顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組小鼠體質(zhì)量均正常增長，低劑量組、高劑量組小鼠體質(zhì)量及各臟器指數(shù)與模型組相比均無顯著差異（P＞0.05），灌胃短梗五加果多酚后小鼠肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)與模型組相比均無顯著性差異（P＞0.05）。短梗五加果多酚對小鼠脾臟指數(shù)有增加的趨勢但并無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明：短梗五加果多酚對小鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)均無顯著性影響。

2.4 短梗五加果多酚對小鼠游泳力竭時(shí)間的影響

由圖2可知，模型組小鼠平均力竭游泳時(shí)間為83.72 min，短梗五加果多酚對小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間有不同程度的延長，低劑量組時(shí)間為98.07 min，延長時(shí)間14.35 min，高劑量組時(shí)間為101.10 min，延長時(shí)間17.38 min，高劑量組和低劑量組與模型組比較均具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明短梗五加果多酚能顯著延長小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間，提高小鼠的運(yùn)動耐力水平。

圖2 短梗五加果多酚對小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響Fig. 2 Effect of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on exhausting swimming time in mice

2.5 短梗五加果多酚對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響

表5 短梗五加果多酚對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響Table 5 Effects of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on liver glycogen and muscle glycogen levels in mice

如表5所示，疲勞模型組小鼠肝糖原平均質(zhì)量濃度降低到2.53 mg/mL，與空白對照組相比降低18.39%。短梗五加果多酚抑制小鼠肝糖原消耗，造模后短梗五加果多酚低劑量和高劑量組質(zhì)量濃度分別為2.92 mg/mL和3.03 mg/mL，與模型組相比消耗量被顯著抑制（P＜0.05）。短梗五加果多酚能有效減少疲勞小鼠肌肉中肌糖原的消耗，與模型組相比短梗五加果多酚低劑量能提高肌糖原含量28.82%（P＜0.01），高劑量能提高肌糖原含量35.08%（P＜0.01）。結(jié)果表明短梗五加果多酚能有效促進(jìn)肝臟和肌肉中糖原合成，特別是提高了肌糖原的儲存能力，同時(shí)減少運(yùn)動引起的肝糖原和肌糖原消耗，提高機(jī)體抗疲勞能力。

2.6 短梗五加果多酚對小鼠血清中谷胱甘肽過氧化物酶、肌酸激酶和乳酸的影響

表6 短梗五加果多酚對小鼠谷胱甘肽過氧化物酶、肌酸激酶和乳酸的影響Table 6 Effects of polyphenols from A. sessilif l orus fruits on glutahione peroxidase creatine kinase activity and lactic acid content in mice

由表6可知，灌胃短梗五加果多酚15 d后，高劑量組和低劑量組的小鼠運(yùn)動后谷胱甘肽過氧化物酶活力均增加，其中低劑量組平均水平提高到114.67 U/mL，與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01）；高劑量組谷胱甘肽過氧化物酶活力水平量提高到109.62 U/mL，與模型組相比差異顯著（P＜0.05）。短梗五加果多酚能明顯降低小鼠血清中乳酸含量，其中短梗五加果酚低劑量組和高劑量組乳酸水平分別降低10.96%和17.44%，與模型組相比具有顯著性差異和極顯著性差異（P＜0.05和P＜0.01）。游泳運(yùn)動促進(jìn)機(jī)體能源物質(zhì)的代謝，導(dǎo)致小鼠血清中肌酸激酶與空白對照組相比含量明顯升高，短梗五加果多酚低劑量組和高劑量組小鼠血清中肌酸激酶水平分別降低到26.43 ng/mL和26.57 ng/mL，與模型組相比差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，短梗五加果多酚能提高小鼠體內(nèi)谷胱甘肽過氧化物酶活力，有效降低小鼠血清中肌酸激酶活性，并能夠不同程度的抑制運(yùn)動后乳酸的含量升高，減輕機(jī)體代謝產(chǎn)物的堆積。

3 結(jié) 論

本研究采用正交試驗(yàn)考察液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對短梗五加果多酚提取率的影響，確定最佳提取工藝參數(shù)為液料比20∶1（mL/g）、提取時(shí)間60 min、提取2 次，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，短梗五加果多酚得率為1.426%。本研究通過負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)建立小鼠運(yùn)動疲勞模型，檢測小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間評價(jià)短梗五加果多酚的抗疲勞作用。機(jī)體運(yùn)動時(shí)，肌肉收縮會消耗體內(nèi)的糖原維持血糖水平，并為肌肉活動提供能量，延緩疲勞的產(chǎn)生[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，短梗五加果多酚能有效減少運(yùn)動引起的肝糖原和肌糖原消耗，增加體內(nèi)能源物質(zhì)肝糖原和肌糖原的含量，增強(qiáng)小鼠游泳耐力，延長小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間，延緩疲勞的產(chǎn)生。短時(shí)間高強(qiáng)度運(yùn)動時(shí)，由于氧供應(yīng)相對不足，糖原代謝增加，血清中乳酸、肌酸激酶等代謝產(chǎn)物增多，從而引起肌肉收縮效率下降導(dǎo)致體力衰竭[27-30]。測定結(jié)果表明短梗五加果多酚均能不同程度的減少運(yùn)動后血清中乳酸、肌酸激酶水平，減輕機(jī)體代謝產(chǎn)物的堆積，改善機(jī)體能量代謝，有利于機(jī)體對抗運(yùn)動性疲勞。目前，不少研究也證實(shí)了多酚類成分能延長疲勞小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，增加肝糖原、肌糖原的儲備，表現(xiàn)出一定的抗疲勞作用[31-32]。

綜上所述，本研究通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了短梗五加果多酚的提取工藝，并發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗疲勞作用，其作用機(jī)制可能與糖原的儲備及能量物質(zhì)的有氧代謝有關(guān)，為其在抗疲勞保健食品的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。