王海燕，曾凡強，王玉蘭，鄭英，戚大石

（1.徐州醫(yī)科大學 人體解剖學教研室，江蘇 徐州 221004；2.揚州大學 組胚教研室，江蘇 揚州 225001；3.徐州醫(yī)科大學 遺傳學教研室，江蘇 徐州 221004）

睪丸特異表達基因的轉錄調控是精子發(fā)生過程中最基本的調節(jié)因素[1]，具有進化上高度保守、生精細胞特異表達或高表達及階段特異性表達的特征[2-3]。因此篩選并研究這些差異表達的基因有望發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生相關的新基因，或發(fā)現(xiàn)已知基因的新功能，研究結果對于揭示人睪丸發(fā)育/精子發(fā)生的分子機制、建立男性不育在分子水平的診斷方法、發(fā)現(xiàn)精子發(fā)生障礙的基因治療手段和尋找男性避孕的新方法均具有重要意義。活化型信號轉導及轉錄激活蛋白抑制蛋白（protein inhibitor of activated STAT, PIAS）家族屬于這類蛋白。目前，真核哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的PIAS家族成員主要包括PIAS1、PIAS2、PIAS3和PIASy[4-6]。PIAS蛋白家族在人睪丸組織中存在著多種調節(jié)機制，同時在睪丸功能中發(fā)揮調節(jié)作用[7]。

PIAS2包括PIASxα、PIASxβ和PIAS-NY 3個成員[1]。序列分析發(fā)現(xiàn)，PIAS-NY是PIASx的一個新的不同剪接體[7]。PIAS-NY mRNA在成人睪丸中高表達，在胚胎睪丸中低表達，而且成人睪丸中的表達水平是胚胎期的14倍；PIAS-NY mRNA特異表達于人睪丸及胰腺中，而在其他器官中未見表達[6]。提示PIAS-NY主要在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。

PIAS-NY作為一種新發(fā)現(xiàn)的睪丸特異表達基因，同其他家族成員一樣，具有典型的N端的SAP結構域、PINIT氨基酸基序及RLD結構域。目前，PIAS-NY相關研究非常少，為了闡述其在精子發(fā)生過程中具體作用機制，本研究構建PIAS-NY原核表達質粒，通過誘導大腸桿菌BL21（DE3）表達融合蛋白，純化后獲得高純度的可溶性原核表達蛋白，多次免疫BalB/C小鼠并制備PIAS-NY多克隆抗體。本研究獲得PIAS-NY全長開放閱讀框，包含PIAS-NY全部結構域，有利于全面開展作用蛋白的深入研究。

1 材料與方法

1.1 材料

LA-Taq DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司，小劑量質粒抽提試劑盒和瓊脂糖凝膠切膠純化試劑盒購于北京BioTeke公司，T4連接酶及質粒pET30a購自美國Promega公司，限制性內切酶EcoRI和XhoI均購自寶生物工程（大連）有限公司，F(xiàn)reund完全佐劑和不完全佐劑購自美國Sigma公司，His-Binding-Resin購自上海悅克生物科技有限公司，透析袋購自美國Solarbio公司,改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco's modification of Eagle's medium Dulbecco, DMEM）購自美國Hyclone公司，新生胎牛血清購自美國Gibco公司，兔抗鼠RUVBL2單克隆抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋有限公司，RIPA裂解液購自武漢博士德生物公司，免疫共沉淀試劑盒購自瑞士Roche公司，超敏化學發(fā)光（Enhanced Chemiluminescence, ECL）試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。人精原cDNA文庫、GC2細胞和293T細胞均由揚州大學鄭英教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲得 PIAS-NY擴增引物根據(jù)Gen Bank基因序列，用Primer 5.0軟件設計，PIAS-NY基因正向引物5'-GGGGAATTCGGATGGCGGATTTCG AAGAGTTG-3'（劃線部分為EcoRI酶切位點），反向引物5'-GGGCTCGAGTTACCCATCTAATATTAGA CTTTC-3'（劃線部分為XhoI酶切位點）。50 μl PCR反應體系：10×LA Tap Buffer 5 μl，dNTP（10 mmol/L）1 μl，Primer F 2 μl，Primer R 2 μl，模板 2 μl，高保真Taq酶0.5 μl，H2O 37.5 μl，反應條件：95℃預熱5 min，95℃變性 30 s，58℃退火60 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃恒溫16 h。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，45 min，割膠回收PIAS-NY片段，大小為1 275 bp。

1.2.2 PIAS-NY-pET30a原核蛋白的誘導表達 將0.5 μl PIAS-NY-pET30a質粒DNA轉化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，37℃ LB/Kan+固體平板上培養(yǎng)過夜。次日，挑選單克隆菌落于10 ml LB液體/Kan+，225 r/min，37℃，過夜。用過夜菌液將250 ml LB液體/Kan+OD調至0.3左右，225 r/min，37℃ 3 h，測得光密度（optical density, OD）值為0.5左右，取出1 ml菌液作為空白對照，剩余菌液中加入終濃度1 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG），兩者同時 225 r/min，37℃4 h，分別取出10 μl菌液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），確定BL21菌株是否表達融合蛋白。陽性菌液3 500 r/min，4℃ 20 min，去除上清液，置入-20℃冰箱冷凍保存。向沉淀中加入 15 ml Binding Buffer A[20 mmol/L Tris-Cl（pH 7.9），0.5 mol/L NaCl，10%甘油]重懸，冰上間斷超聲裂解菌體（功率25%、超聲5 s、間歇5 s，總工作時間600 s），3 500 r/min、4℃、10 min，分別收集上清液和沉淀，向沉淀中加入15 ml Binding Buffer B（破菌緩沖液B：破菌緩沖液A加入8 mol/L尿素），繼續(xù)超聲懸浮液（功率25%、超聲5 s、間歇5 s，總工作時間600 s），3 500 r/min、4℃、10 min，分別收集蛋白上清液和沉淀。SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，確定PIAS-NY-pET30a原核表達融合蛋白以哪種形式存在于大腸桿菌中。

1.2.3 透析袋預處理 將透析管裁剪成30 cm小段，將2%（m/V）碳酸氫鈉和1 mmol/L 乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）（pH=8.0）溶液煮沸，透析袋浸泡其中煮沸10 min；用蒸餾水徹底漂洗；1 mmol/L EDTA（pH=8.0）溶液煮沸，透析袋浸泡煮沸10 min；室溫冷卻，蒸餾水徹底漂洗，4℃蒸餾水完全浸泡保存。整個過程全部帶手套操作，使用前必須仔細檢查，不漏方可使用。

1.2.4 融合蛋白純化及復性 用His-Binding-Resin對收集融合蛋白進行純化，以下整個過程均在4℃完成。安裝好His-Ni柱，先用10 ml Binding Buffer B平衡去除穿透液體。將3 ml融合蛋白上清液加入純化柱中，收集穿透夜，以觀察吸附效果。加入蛋白樣品，滴完后用2.5 ml Binding Buffer B洗柱1遍，盡量去除非特異性吸附的雜蛋白。依次用2 ml Eluting buffer洗脫（破菌緩沖液B中加入不同終濃度咪唑，濃度依次為5、25、50、100及200 mmol/L），控制滴速2～3 ml/h，分段收集洗脫液。用5 ml Binding Buffer B過柱，將上述收集的咪唑洗脫液進行SDS-PAGE電泳鑒定。發(fā)現(xiàn)100和200 mmol/L洗脫液中含有較高濃度目的蛋白，將100和200 mmol/L洗脫液混合液裝入激活的透析袋中，4℃依次經(jīng)過7、6、5、4、3及2 mol/L尿素緩沖液進行透析復性，各梯度濃度分別復性24 h，最后收集蛋白液體。用Bradford法測定蛋白濃度。以200 μl/管進行蛋白分裝，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.5 免疫小鼠制備抗體 用苦味酸對20只20 g BalB/C小鼠進行隨機標記，從1連續(xù)到20，隨機挑選出3只作為陰性對照。取2管蛋白液體融化，分別加入等體積的Freund完全佐劑充分混合乳化后，按照100 μg/只蛋白劑量進行BalB/C小鼠腹腔注射，對照組注射等體積1×PBS緩沖液和Freund完全佐劑。2周后，取2管蛋白液體加等體積Freund不完全佐劑充分混合，按100 μg/只小鼠BalB/C小鼠腹腔注射。每隔2周加強1次，共4次。2個月后，將免疫好的小鼠眼球取血，收集血清。分裝后作好標記，置入-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）抗血清滴度 將純化PIAS-NY蛋白用包被液稀釋至所需濃度5 μg/ml，96孔板中每孔加入100 μl，將96孔板放入濕盒，4℃過夜；次日，去除包被液，用PBS-T洗滌3次，5 min/次；加入含0.1%脫脂奶粉PBS-T，每孔150 μl，37℃封閉1 h；去除封閉液，PBS-T洗滌3次，5 min/次；按比例稀釋PIAS-NY抗血清（1∶100、1∶1 000、1∶104、1∶105及1∶106），每孔加入100 μl，同時以BalB/C小鼠血清為陰性對照，37℃孵育70 min；PBS-T洗滌3次，5 min/次；二抗孵育：山羊抗小鼠IgG（1∶1 000倍稀釋于PBS-T），每孔加入100 μl，37℃孵育60 min，PBS-T洗滌3次，5 min/次，加顯色液100 μl，室溫避光保存10 min，加入2滴終止液，終止反應，酶標儀讀數(shù)（A490）。

1.2.7 免疫共沉淀 293T細胞鋪6孔板，4℃預冷PBS輕輕洗滌細胞表面3次，每孔加入Roche免疫共沉淀試劑盒中的lysis buffer1 80 μl，冰上5～10 min，用刮棒將每孔內細胞裂解物刮干凈，吸出于一EP管中，冰上30 min（每5 min上下顛倒混勻1次）。4℃13 000 r/min 15 min。將上清吸至另一EP管中，置于冰上。取出60 μl上清液液，剩余蛋白液體平均分為2份，每份分別加入鼠IgG和PIAS-NY抗血清各8 μl（或者兔IgG和RUVBL2單克隆抗體各8 μl）。4℃冰箱，滾筒上2 h。取80 μl protein G小珠子于一EP管中，10 000 r/min 20 s棄上清液，加500 μl lysis buffer1，混勻，10 000 r/min，棄上清液。2 h后將2份蛋白上清分別加入含小珠子的EP管中，混勻。4℃滾筒上過夜。次日，上下翻轉，4℃ 10 000 r/min 20 s，棄上清。每管中加入500 μl lysis buffer 1洗滌珠子，上下翻轉，4℃10 000 r/min 10 s，棄上清液。1 ml的wash buffer 2洗滌珠子，上下翻轉，4℃10 000 r/min 10 s，棄上清液。1 ml的wash buffer 3洗滌珠子，上下翻轉，4℃ 10 000 r/min 10 s棄上清液。加35 μl的1×loading buffer，混勻，煮沸5 min，上下翻轉，4℃ 10 000 r/min 5 min收集上清液，即為興趣蛋白-目的蛋白混合物。SDS-PAGE電泳后分別用兔源RUVBL2抗體免疫印跡檢測。

2 結果

2.1 PIAS-NY-pET30a質粒的構建與鑒定結果

1.5%瓊脂糖凝膠電泳得到5 388和1 275 bp片段（見圖1）。測序結果中插入片段序列與PIAS-NY基因開放閱讀框序列完全一致，因此原核表達載體PIASNY-pET30a已構建成功。

2.2 PIAS-NY原核表達情況

與誘導前菌液和對照組比較，誘導后大腸桿菌中均存在一分子量約為43 kD且表達量相當高的蛋白條帶。與融合蛋白His-PIAS-NY 45 kD大小十分接近，而且僅存在2個IPTG誘導實驗組中。因此提示PIAS-NY原核表達成功。見圖2。

圖1 PIAS-NY-pET30a重組質粒電泳圖

2.3 His-PIAS-NY-His蛋白的純化及復性

His-PIAS-NY-His融合蛋白主要存在于沉淀中，即以包涵體形式存在于大腸桿菌BL21中。100 mmol/L咪唑洗脫液和200 mmol/L咪唑洗液脫液中含高純度蛋白。見圖3。

2.4 Western blot檢測結果

與對照組相比所得抗體效價均達到1∶100 000。PIAS-NY抗血清能夠特異性識別GC2細胞和293T細胞中的PIAS-NY蛋白。見圖4。

2.5 免疫共沉淀檢測情況

293T細胞總蛋白中PIAS-NY抗血清沉淀出的復合物中存在RUVBL2蛋白，而且與293T細胞中的RUVBL2蛋白大小一致，然而BalB/C小鼠血清沉淀復合物中并未發(fā)現(xiàn)RUVBL2蛋白。結果顯示制備的多克隆抗體在分子水平對蛋白具有特異識別作用。見圖5。

圖2 誘導前后菌液SDS-PAGE電泳圖

圖3 His-PIAS-NY純化SDS-PAGE電泳圖

圖4 PIAS-NY多克隆抗體特異性

圖5 PIAS-NY多克隆抗體特異性

3 討論

抗體的制備技術經(jīng)歷很長時間的發(fā)展。包括多克隆抗體階段、單克隆抗體階段和基因工程抗體階段[8]。目前實驗過程中使用的抗體多為市場化的單克隆抗體，但對一些效果不太理想或者市場上沒有的蛋白質抗體，實驗室制備多克隆抗體滿足一些實驗需求。

PIAS蛋白家族最初是作為激活STAT轉錄活性的抑制蛋白被發(fā)現(xiàn)的[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，PIAS蛋白可以與60多種蛋白作用參與多種細胞活動[10]，涉及到胚胎發(fā)育、造血肝干細胞自我更新[11]、先天性和后天適應性免疫反應[12]、空間學習和長期記憶等多個方面[13]。PIAS-NY基因是2004年新發(fā)現(xiàn)，相關研究報道非常少。之前的研究主要集中在細胞mRNA水平，而蛋白水平未見報道。因此，制備抗體是繼續(xù)深入開展蛋白水平研究的基礎。本實驗用到的全部分子生物學技術是研究生階段時鄭英教授課題組實驗室的固有技術，現(xiàn)均已成熟掌握。原核蛋白表達、提取、純化和復性等一系列美國國立衛(wèi)生研究院的實驗原理和方法能深刻理解并能成熟運用，之前所在實驗室也已成功制備出人NYD-SP28多克隆抗體[14]和Setd8多克隆抗體[15]。

基于前期的工作，筆者制備PIAS-NY多克隆抗體。誘導的融合蛋白中包括了蛋白PIAS-NY全部氨基酸序列，并且氨基端和羧基端均存在His標簽，大大提高融合蛋白和Ni柱的親和性，咪唑洗脫后獲得高濃度可溶性融合蛋白。經(jīng)過濃度梯度尿素稀釋復性后，筆者獲得具有一定空間構像的PIAS-NY免疫原。純化蛋白經(jīng)過充分乳化后，6次腹腔注射BalB/C小鼠。雖然BalB/C小鼠廣泛用于免疫學、生理學的動物實驗，但由于小鼠本身存在免疫缺陷，因此在免疫過程中仍應注意小鼠的健康狀態(tài)。實驗組共17只小鼠，最終只有13只小鼠存活，眼球取血。

ELISA檢測所有存活小鼠的血清效價均在1∶100 000以上；Western blot也證實抗血清能夠特異性識別293T細胞和GC2細胞的PIAS-NY蛋白；免疫共沉淀實驗結果也說明抗血清能夠識別并結合自然狀態(tài)下PIAS-NY蛋白，同時也提示真核哺乳細胞中PIAS-NY與RUVBL2存在相互作用。而RUVBL2是進化上高度保守的AAA+家族的成員之一，在睪丸中高表達，具有ATP酶活性，與同源蛋白RUVBL1形成多聚物參與到不同的細胞活動中[16-17]，如有絲分裂紡錘體的組裝[18-20]、端粒酶的形成[21]、染色體重塑等[22-25]，但是具體的分子機制并不清楚。通過質譜對睪丸RNA結合蛋白組學進行了分析，包括17種蛋白質，在圓形精細胞中表達量均比長形精子中高3倍，而RUVBL2是其中之一[26]。這也提示PIAS-NY和RUVBL2在精子發(fā)生中共同發(fā)揮重要作用。

綜上所述，實驗過程中已成功制備出PIAS-NY多克隆抗體，為下一步進行蛋白的功能和機制研究打下了一定的基礎。