張少華，王君實(shí)，董維鵬，燕炯

（山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，山西 太原 030001）

脂代謝紊亂和脂質(zhì)合成分解障礙可致肥胖癥的發(fā)生[1]。脂滴已被證實(shí)是一種在脂代謝中起重要作用的細(xì)胞器，主要成分是三酰甘油（triglyceride,TG）和膽固醇酯，脂滴表面有多種功能蛋白[2]。圍脂滴蛋白（perilipin 1, PLIN1）作為PAT家族蛋白的一員，主要定位于脂滴表面，在脂肪分解代謝起屏障保護(hù)作用的一種可磷酸化蛋白[3-5]。短發(fā)卡RNA（small hairpin RNA, sh-RNA） 是 RNA干 擾（RNA interference, RNAi）技術(shù)的一種，可有效地降解同源序列的mRNA，進(jìn)而抑制靶基因的表達(dá)[6]。本課題組前期已成功構(gòu)建PLIN1基因的sh-RNA高效干擾載體，并已成功驗(yàn)證其可有效促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂解作用[7]。

黃酮類化合物廣泛存在于蔬菜水果中，具有強(qiáng)抗氧化性、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂等生物學(xué)活性[8]。楊梅素（myricetin, Myric）作為黃酮類植物化學(xué)物中比較有代表性的的一種，可以通過降低PLIN1表達(dá)、磷酸化激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase, HSL），進(jìn)而加速脂肪分解，降低TG和膽固醇[9-10]。

本研究擬通過Myric與PLIN1基因sh-RNA高效干擾載體聯(lián)合干預(yù)，觀察其對3T3-L1脂肪細(xì)胞脂解效率的影響，并探討其可能機(jī)制，為今后肥胖癥的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

3T3-L1前脂肪細(xì)胞系（小鼠胚胎成纖維細(xì)胞）由山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科惠贈(zèng)，胎牛血清、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液（100 ml）及青鏈霉素混合液（×100）購自武漢Boster生物工程有限公司，TG檢測試劑盒（美國Amresco公司），甘油檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），Myric（上海阿拉丁試劑有限公司），Lipofectamine ? LTX & Plus Reagent（美國Invitrogen公司），PLIN1A抗體、HSL抗體、ATGL抗體和β-Actin抗體購自英國Abcom公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Eon型微孔板分光光度計(jì)（美國Bio-Tek公司），DM3000B型倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），JY92-Ⅱ型超聲細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝器械研究所），DYCZ-40D型電泳儀（北京六一儀器廠），Neofuge 23R型低溫高速離心機(jī)（上海Heal Force公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞的復(fù)蘇﹑培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 從液氮中取出3T3-L1前脂肪細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞長滿時(shí)轉(zhuǎn)移到6孔板中。

采用經(jīng)典“雞尾酒”方法對3T3-L1前脂肪細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞[11]。在細(xì)胞融合到80%左右時(shí)，將完全培養(yǎng)基換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ，2 d后換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后更換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每2天換液1次，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞成功后進(jìn)行后續(xù)操作。

1.3.2 Myric干預(yù)條件的篩選 在3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞第8天后換成含Myric的培養(yǎng)基，分為6組：100、50、10、5、1及0 μmol/L，每組分別干預(yù)48和72 h，檢測TG和甘油含量。

1.3.3 聯(lián)合干預(yù) 誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞后，Myric聯(lián)合sh-RNA重組干擾載體進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，共分4組：聯(lián)合干預(yù)組（Myric+sh-RNA）、轉(zhuǎn)染組（sh-RNA）、Myric組（Myric）和空白組。

根據(jù)本課題組前期優(yōu)化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件，以質(zhì)量體積比為1∶2的方式將質(zhì)粒與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)脂肪細(xì)胞。轉(zhuǎn)染5 h后，對聯(lián)合組和Myric組換成含有Myric的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h；對轉(zhuǎn)染組和空白組換成正常的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.3.4 脂肪細(xì)胞油紅O染色 聯(lián)合干預(yù)完成后，每孔加入1 ml 4%多聚甲醛溶液，室溫下靜置2 h。用移液管吸掉，加入油紅O工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。1 h后，去離子水沖洗2遍，鏡下觀察并拍照。

1.3.5 細(xì)胞中TG及甘油含量檢測 Myric干預(yù)后，將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，冰水浴條件下進(jìn)行超聲破碎，TG試劑盒檢測，于酶標(biāo)儀上546 nm波長處測定TG含量。甘油測定時(shí)需將細(xì)胞裂解液放于70℃水浴10 min，滅活脂肪酶，甘油試劑盒檢測，于酶標(biāo)儀550 nm處測定其吸光度，用蛋白濃度對測定值進(jìn)行校正。

1.3.6 Western blot檢測細(xì)胞中PLIN1A﹑HSL和ATGL蛋白表達(dá) 提取各組蛋白，測定并調(diào)平濃度。制備凝膠，每孔中加50 μg待測樣品，樣品兩端的孔中加入5 μl Marker。80 V跑濃縮膠，120 V跑分離膠，220 mA恒定電流進(jìn)行濕式轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉2 h。用封閉液對一抗進(jìn)行稀釋，4℃過夜。二抗孵育時(shí)37℃搖床70 min。取出條帶，加入ECL發(fā)光工作液，合上暗盒暗室曝光。Image J軟件對目的蛋白條帶進(jìn)行分析并測定灰度值，以β-actin條帶灰度值進(jìn)行校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Myric不同濃度、不同干預(yù)時(shí)間對TG含量的影響

不同濃度Myric干預(yù)48和72 h后的TG含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.823和125.113，均P=0.000）。隨著Myric干預(yù)濃度的提高，細(xì)胞內(nèi)TG含量逐漸降低，干預(yù)濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，細(xì)胞內(nèi)TG含量為最小值。100 μmol/L時(shí)48和72 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同劑量的Myric及不同干預(yù)時(shí)間對TG含量的影響[mmol/（g·protein），±s]

表1 不同劑量的Myric及不同干預(yù)時(shí)間對TG含量的影響[mmol/（g·protein），±s]

注：1）與同時(shí)間其他濃度比較，P ＜0.05；2）與同濃度48 h比較，P ＜0.05

TG 48 h 72 h 0 μmol/L 0.1 730±0.0 099 0.1 867±0.0 034 1 μmol/L 0.1 712±0.0 110 0.1 857±0.0 046 5 μmol/L 0.1 607±0.0 033 0.1 623±0.0 058 10 μmol/L 0.1 580±0.0 041 0.1 555±0.0 033 50 μmol/L 0.1 470±0.0 060 0.1 406±0.0 017 100 μmol/L 0.1 393±0.0 0301） 0.1 259±0.0 0371）2）F值 10.823 125.113 P值 0.000 0.000組別

2.2 Myric不同劑量、不同干預(yù)時(shí)間對甘油含量的影響

不同濃度Myric干預(yù)48和72 h后的甘油含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=107.296和99.920，均P=0.000）。Myric干預(yù)后，細(xì)胞中甘油含量隨著干預(yù)濃度的提高而逐漸升高，尤其當(dāng)干預(yù)濃度為100 μmol/L時(shí)，甘油含量最高。100 μmol/L Myric干預(yù)48與72 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對TG和甘油含量的影響

4組TG和甘油含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=384.875和102.557，均P=0.000）。其中Myric+sh-RNA組細(xì)胞內(nèi)TG含量最低，甘油含量最高（P＜0.05）；與空白組比較，sh-RNA組和Myric組細(xì)胞內(nèi)TG含量下降，甘油含量上升（P＜0.05）。見表3。

2.4 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對脂滴形態(tài)及分布的影響

顯微鏡下觀察：空白組脂滴密度極大，油紅O染色顏色深，大脂滴數(shù)量多；sh-RNA和Myric組脂滴呈戒環(huán)樣結(jié)構(gòu)圍繞細(xì)胞核，與空白組比較，脂滴密度相對減小，染色顏色變淺，大脂滴數(shù)量減少；聯(lián)合干預(yù)組鏡下脂滴數(shù)量進(jìn)一步減少，顏色進(jìn)一步變淺，無大脂滴存在。見圖1。

表2 不同劑量Myric及不同干預(yù)時(shí)間對甘油含量的影響[mmol/（g·protein），±s]

表2 不同劑量Myric及不同干預(yù)時(shí)間對甘油含量的影響[mmol/（g·protein），±s]

注：1）與同時(shí)間其他濃度比較，P ＜0.05；2）與同濃度48 h比較，P ＜0.05

甘油48 h 72 h 0 μmol/L 0.0 374±0.0 041 0.0 414±0.0 084 1 μmol/L 0.0 376±0.0 069 0.0 438±0.0 058 5 μmol/L 0.0 419±0.0 061 0.0 498±0.0 069 10 μmol/L 0.0 548±0.0 067 0.0 837±0.0 0762）50 μmol/L 0.0 947±0.0 075 0.1 220±0.0 1112）100 μmol/L 0.1 326±0.0 0721） 0.1 737±0.0 1321）2）F值 107.296 99.920 P值 0.000 0.000組別

表3 Myric與sh-RNA聯(lián)合干預(yù)對TG和甘油含量的影響[mmol/（g·protein），±s]

表3 Myric與sh-RNA聯(lián)合干預(yù)對TG和甘油含量的影響[mmol/（g·protein），±s]

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與sh-RNA組比較，P ＜0.05；3）與 Myric組比較，P ＜0.05

組別 TG 甘油Myric+sh-RNA 0.0 873±0.0 0481）2） 0.2 194±0.0 1121）2）sh-RNA 0.1 471±0.0 0461）3） 0.1 190±0.0 0591）Myric 0.1 305±0.0 0361） 0.1 724±0.0 1011）空白組 0.1 885±0.0 016 0.0 431±0.0 051 F值 384.875 102.557 P值 0.000 0.000

2.5 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對PLIN1A蛋白表達(dá)的影響

各組PLIN1A蛋白表達(dá)含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.010，P=0.000）。Myric+sh-RNA 組PLIN1A蛋白表達(dá)含量較其他3組降低（P＜0.05）；與空白組比較，sh-RNA組與Myric組PLIN1A蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05）。見圖2。

圖1 脂滴油紅O染色結(jié)果 （×400）

圖2 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對PLIN1A蛋白表達(dá)的影響

2.6 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對脂解酶HSL和ATGL蛋白表達(dá)的影響

各組HSL和ATGL蛋白表達(dá)含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=78.222和80.831，均P=0.000）。與其他3組比較，聯(lián)合干預(yù)組HSL和ATGL蛋白表達(dá)量上升（P＜0.05）；與空白組比較，sh-RNA組與Myric組HSL和ATGL蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）。見圖3、4。

圖3 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對HSL蛋白表達(dá)的影響

圖4 Myric與sh-RNA聯(lián)合作用對ATGL蛋白表達(dá)的影響

3 討論

3T3-L1前脂肪細(xì)胞是從小鼠分離出的具有特定分化潛能的細(xì)胞系，其本身不具有脂肪細(xì)胞的特性，但能被誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞，常被作為理想的脂代謝、細(xì)胞分化模型[12-13]。脂滴是TG在脂肪細(xì)胞中主要的儲(chǔ)存形式。TG的分解代謝主要在ATGL和HSL的作用下進(jìn)行[14-15]。

在脂肪細(xì)胞中，PLIN1蛋白錨定于脂滴表面產(chǎn)生支持屏障作用，將TG與脂肪水解酶隔斷，保護(hù)其不被分解。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下調(diào)PLIN1時(shí)，其屏障作用減弱，脂肪水解酶活性增強(qiáng)，脂解速率加快，脂滴變小，細(xì)胞內(nèi)TG含量降低[16]。

Myric干預(yù)條件的篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著Myric干預(yù)濃度的升高以及干預(yù)時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)TG含量逐漸降低，甘油含量逐漸升高。通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)Myric干預(yù)濃度大于100 μmol/L，干預(yù)時(shí)間72 h時(shí)，細(xì)胞存活率低于80%；當(dāng)干預(yù)濃度為100 μmol/L，干預(yù)時(shí)間超過72 h時(shí)，細(xì)胞存活率同樣低于80%，均存在一定細(xì)胞毒性。因此，結(jié)合文獻(xiàn)查閱結(jié)果，最終確定Myric最佳干預(yù)濃度和干預(yù)時(shí)間分別為100 μmol/L和72 h，這與QIAN WANG等[9]的研究結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果顯示，Myric+sh-RNA聯(lián)合干預(yù)組較其他3組細(xì)胞內(nèi)TG含量降低，甘油含量則升高，幾乎觀察不到大脂滴的存在，脂滴數(shù)量也減少。而聯(lián)合干預(yù)組較單獨(dú)干預(yù)組PLIN1A蛋白表達(dá)量更低，HSL和ATGL蛋白表達(dá)量更高。因此本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，Myric與下調(diào)PLIN1基因聯(lián)合作用比它們各自單獨(dú)干預(yù)更能有效地促進(jìn)脂肪分解，楊梅素和sh-PLIN1干擾載體引起的脂解加快可能是通過降低PLIN1A蛋白表達(dá)，上調(diào)脂肪酶HSL、ATGL的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。