劉恩令，劉錚，周玉秀，李君，張冬紅，蔡朝輝，王立群，陳梅，鄭寰宇

（1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，天津 300052；3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，河北 唐山 063000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）是一種常發(fā)于生育年齡婦女，影響多個(gè)器官的慢性自身免疫性疾病[1]。SLE主要在女性群體中發(fā)病，更常見于非洲裔女性[2]。生育年齡女性妊娠可導(dǎo)致流產(chǎn)、胎死宮內(nèi)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩等，但經(jīng)過孕前評(píng)估、孕期檢測(cè)和免疫抑制治療等措施，妊娠的結(jié)局可明顯改善[3]。遺傳，種族，激素和環(huán)境因素等都會(huì)影響到SLE的發(fā)生發(fā)展，發(fā)病機(jī)制為一種惡性循環(huán)的自身抗原暴露，產(chǎn)生自身抗體，導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷[4-6]。越來越多的研究證實(shí)，表觀遺傳因素，特別是CD4+T細(xì)胞中異常的DNA甲基化模式，在SLE的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[7]，最近的研究表明，miRNA-185可以直接靶向作用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1, DNMT1），從而導(dǎo)致全基因組甲基化（Genome DNA methylation, GDM）的減少和調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中啟動(dòng)子-超甲基化基因的表達(dá)[8]。然而，miRNA-185如何通過調(diào)控DNMT1的表達(dá)和基因組DNA甲基化，從而影響SLE的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚未有系統(tǒng)的探討。本研究的主要目的是闡明miRNA-185及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在SLE患者的T細(xì)胞的表達(dá)，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選擇30例患有SLE的妊娠女性患者為實(shí)驗(yàn)組，平均（31.90±10.72）歲。對(duì)照組為30例健康女性的志愿者,平均（31.21±11.40）歲。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的年齡，性別和種族等均具有可比性，且均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和知情同意。所有患者都符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)。用SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）評(píng)估SLE活性。所有參與者都來自中國(guó)漢族人群。合并感染者被排除在研究之外。收集所有受試者外周血樣本，用含有A型枸櫞酸葡萄糖的采血管采集。

1.2 T細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

通過密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC），通過磁珠陽(yáng)性選擇分離法分離CD4+T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)[平均純度（95.5±1.21%）]進(jìn)行純度評(píng)估。分離得到的細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染過程按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，使用人T細(xì)胞Nucleofector試劑盒和Amaxa核轉(zhuǎn)染技術(shù)（V-24程序），用FAM標(biāo)記的miRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞。核轉(zhuǎn)染后48 h分析DNMT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，核轉(zhuǎn)染后72 h檢測(cè)甲基化敏感性基因的水平。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中miRNA-185和DNMT1基因的表達(dá)

使用Trizol試劑按照說明書從細(xì)胞系中提取總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒分別進(jìn)行mRNA和miRNA的逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）。所有反應(yīng)都進(jìn)行3組平行試驗(yàn)。通過U6和β-肌動(dòng)蛋白對(duì)miRNA進(jìn)行定量。根據(jù)2-ΔΔCt公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。引物如下：DNMT1，正向5'-CGGTTCTT CCTCCTGGAGAATGTCA-3'，反向5'-CACTGATAGC CCATGCGGACCA-3'；β-肌動(dòng)蛋白，正向5'-GCACC ACACCTTCTACAATGAGC-3'，反向 5'-GGATAGCACA GCCTGGATAGCAAC-3'。miRNA-185和U6的引物購(gòu)自上海Genepharm公司。

為驗(yàn)證DNMT1是否是miRNA-185的直接靶標(biāo)，構(gòu)建含有DNMT1 3'-UTR中miRNA-185的潛在結(jié)合位點(diǎn)的螢光素酶報(bào)告基因。分成miRNA-185模擬物、miNAR-185抑制劑和陰性對(duì)照組，然后將構(gòu)建載體與miRNA-185模擬物miRNA-185抑制劑或陰性對(duì)照一起共轉(zhuǎn)染到CD4+T細(xì)胞中，并在轉(zhuǎn)染后48 h測(cè)量熒光素酶活性。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)miRNA-185和DNMT1蛋白的表達(dá)

將細(xì)胞在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中在冰上裂解30 min。10 000 r/min，4℃離心10 min至裂解液澄清。通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)并通過轉(zhuǎn)移電泳將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在含有0.1% Tween-20的Tris中用5%（W/V）脫脂牛奶封閉硝酸纖維素膜。將膜與一抗反應(yīng)過夜，與共價(jià)結(jié)合有HRP的二抗在室溫條件下反應(yīng)1 h。用ECL技術(shù)觀察條帶?？笵NMT1抗體、抗CD11a抗體、抗CD70抗體和抗β-肌動(dòng)蛋白抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。使用Quantity One軟件定量相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，行t檢驗(yàn)或方差分析，方差分析的兩兩比較用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 妊娠合并SLE患者的CD4+T細(xì)胞中miRNA-185表達(dá)與DNMT1的相關(guān)性

兩組患者的CD4+T細(xì)胞中miRNA-185表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.732，P=0.0036），實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組，見圖1A。而DNMT1的結(jié)果正好相反（t=4.016，P=0.002），見圖1B。此外，Pearson相關(guān)分析顯示，miRNA-185的表達(dá)量與DNMT1表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.8432，P=0.0000）,見圖1C。

2.2 miRNA-185對(duì)DNMT1的靶向性

miRNA-185模擬物組miRNA-185表達(dá)高于其他兩組（F=3.021，P=0.015），見圖2A；miRNA-185抑制劑組miRNA-185表達(dá)低于其他兩組（F=3.932，P=0.0027），見圖2B。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miRNA-185能夠抑制攜帶野生型3'-UTR的DNMT1報(bào)告基因載體的活性。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，miRNA-185的過表達(dá)會(huì)降低DNMT1的蛋白水平（P＜0.05），而敲除miRNA-185則促進(jìn)DNMT1蛋白水平的提高（P＜0.05），見圖2C和2D。

2.3 miRNA-185的表達(dá)與全基因組DNA甲基化和CD11a和CD70表達(dá)的相關(guān)性

圖1 妊娠合并SLE患者的CD4+ T細(xì)胞中miRNA-185和DNMT1 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

圖2 miRNA-185對(duì)DNMT1的靶向性

經(jīng)過轉(zhuǎn)染帶有miRNA-185模擬物或陰性對(duì)照的CD4+T細(xì)胞，然后再轉(zhuǎn)染72 h后測(cè)定DNA甲基化水平、CD11a和CD70的mRNA和蛋白質(zhì)水平。如圖3A所示，miRNA-185的上調(diào)降低全基因組DNA甲基化水平，并且增加CD11a和CD70的mRNA（見圖3B）和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（見圖3C）。另外，本研究采用亞硫酸氫鹽測(cè)序來確定用miRNA-185轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞后CD70和CD11a啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD11a和CD70啟動(dòng)子的甲基化水平降低（見圖3D），這與兩種基因的mRNA和蛋白表達(dá)增加一致。

圖3 miRNA-185的表達(dá)與CD11a和CD70表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是累及多系統(tǒng)、多臟器的自身免疫性疾病，常導(dǎo)致多臟器損傷，而孕期可相互影響，妊娠可加重系統(tǒng)性紅斑狼瘡，導(dǎo)致臟器損傷加重，而狼瘡可導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，甚至母嬰死亡的危險(xiǎn)[9]。而導(dǎo)致狼瘡患者母嬰不良結(jié)局的機(jī)制尚不清楚。DNA甲基化是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本決定因素，對(duì)基因表達(dá)具有有效的抑制作用。最近研究表明，T細(xì)胞DNA去甲基化在SLE的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[10]。用肼苯達(dá)嗪、普魯卡因酰胺、5-氮胞苷（5-azaC）等DNA甲基化抑制劑處理鼠或人T細(xì)胞后，可以誘發(fā)狼瘡樣綜合征，而停用該藥物后，癥狀逐漸消退[l1-12]，證明T細(xì)胞DNA低甲基化可能在SLE發(fā)病中起作用。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）是基因組甲基化狀態(tài)和強(qiáng)度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。目前，已經(jīng)確定3種具有催化活性的DNMT，即DNMT1、DNMT3A和DNMT3B[13]。DNMT1是基礎(chǔ)性表達(dá)基因，在DNA復(fù)制期間負(fù)責(zé)DNA甲基化的正常進(jìn)行。本研究通過檢測(cè)妊娠合并SLE患者的T細(xì)胞樣本，發(fā)現(xiàn)miRNA-185在CD4+細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。從機(jī)制上看，miRNA-185與SLE中的DNA低甲基化有關(guān)，通過直接抑制DNMT1的表達(dá)參與SLE的發(fā)病機(jī)制。

在本研究中筆者還發(fā)現(xiàn)，來自健康對(duì)照的CD4+T細(xì)胞中miRNA-185的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致全基因組DNA和CD11a和CD70基因啟動(dòng)子甲基化程度下調(diào)，其他相關(guān)基因的上調(diào)。如果敲除SLE患者的CD4+T細(xì)胞中的miRNA-185，會(huì)提高DNMT1的表達(dá)，可降低甲基化敏感性基因的表達(dá)。綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，或許可以認(rèn)為干預(yù)miRNA-185的表達(dá)水平，從而為SLE提供有效的干預(yù)治療方案。

總之，妊娠合并SLE患者的CD4+T細(xì)胞中miRNA-185的表達(dá)量增加，并且與DNMT1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，miRNA-185可直接降低DNMT1的表達(dá)水平，從而導(dǎo)致DNA的低甲基化和甲基化敏感性基因的過度表達(dá)，介導(dǎo)SLE的發(fā)病機(jī)制。因此，本研究為SLE的干預(yù)治療提供了新的策略，從而為進(jìn)一步改善此類患者的預(yù)后提供理論依據(jù)。