秦海霞，李少平，張全華，王世進(jìn)，吳向暉

[1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦科，河南 衛(wèi)輝 453100；2.河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院） 婦科，河南 洛陽 471003]

盡管根治性手術(shù)聯(lián)合同步放化療治療早期宮頸癌（ⅡA期及以下）的治愈率達(dá)80%～95%，但中晚期及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移宮頸癌的局部控制率和總生存期仍不盡如人意[1]。因此，探尋更安全、有效的宮頸癌治療方案具有十分重要的臨床意義。微小RNA（microRNA,miRNA）作為內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過與下游一個(gè)或多個(gè)靶基因的3'-非翻譯區(qū)（untranslated region, UTR）相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞分化、增殖及凋亡等病理生理過程[2]。miRNAs參與調(diào)控惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的觀點(diǎn)得到普遍認(rèn)同，其已成為腫瘤生物靶向治療的重要靶點(diǎn)[3]。miRNA-375是新發(fā)現(xiàn)的miRNA成員。研究證實(shí)，miRNA-375在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮類似抑癌基因的作用，但其分子機(jī)制尚未完全明確[4]。磷脂酰肌醇激酶3催化亞單位α（PIK3CA）是公認(rèn)的促癌基因，其基因突變所致的過表達(dá)可導(dǎo)致磷脂酰肌醇3-羥激酶（phosphatidyl Inositol 3-kinase, PI3K）的催化活性增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。既往研究證實(shí)，PIK3CA在宮頸癌組織中高表達(dá)，提示PIK3CA參與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展，而調(diào)控PIK3CA表達(dá)可能是宮頸癌靶向治療的新思路[5]。本研究前期采用miRNA靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA-375與PIK3CA存在靶向關(guān)系，miRNA-375是否可通過靶向PIK3CA調(diào)控宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為尚未可知。本研究旨在探討miRNA-375靶向PIK3CA對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移的影響，以期為宮頸癌的臨床診療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系SiHa購(gòu)于美國(guó)ATCC，DMEM培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，PIK3CA單克隆抗體購(gòu)自大連TaKaRa公司，雙熒光素酶試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，miRNA-375模擬基因、miRNA-375抑制劑、對(duì)照模擬基因、對(duì)照抑制劑購(gòu)于美國(guó)Ambion公司。

1.2 細(xì)胞分組

常規(guī)復(fù)蘇SiHa細(xì)胞，用含有1%雙抗+10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，37℃、5% 二氧化碳CO2恒溫培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞并接種于6孔培養(yǎng)板中，2×105個(gè)/孔，后細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞隨機(jī)分為4組，每組3孔，即對(duì)照模擬基因組、對(duì)照抑制劑組、miRNA-375模擬基因組、miRNA-375抑制劑組，各組分別轉(zhuǎn)染對(duì)照模擬基因、對(duì)照抑制劑、miRNA-375模擬基因、miRNA-375抑制劑，細(xì)胞繼續(xù)置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染結(jié)束后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miRNA-375表達(dá)

收集各組細(xì)胞，采用RT-PCR法檢測(cè)miRNA-375表達(dá)。依據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，后行RT-PCR（SYBR Green法），以U6為內(nèi)參。miRNA-375逆轉(zhuǎn)錄引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTG GATACGAC-3'；miRNA-375正向 5'-TTTGTTCGTTCG GCTCGC-3'，反向 5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向5'-AACG CTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.4 Western blot檢測(cè)PIK3CA蛋白表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，測(cè)定樣品蛋白濃度，取適量樣品行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，將膜置于5%封閉液4℃封閉4 h，后依次加入PIK3CA單克隆抗體（1∶2 000）、二抗（1∶500）孵育，按ECL試劑盒說明書操作行電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)顯色。利用Gene Tools軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照，以蛋白灰度值/β-actin的灰度值的比值表示PIK3CA蛋白的相對(duì)表達(dá)量來進(jìn)行量化。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將細(xì)胞置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、36及72 h時(shí)，離心棄上清液每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20μl，繼續(xù)37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)4 h，離心棄上清液，加入DMSO（100μl/每孔），振蕩至結(jié)晶物充分溶液，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處光密度值（OD值）。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

收集各轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合率達(dá)到90%左右時(shí)，用200 μl槍頭垂直于6孔板底部做橫線劃痕，之后細(xì)胞繼續(xù)置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5% CO2）中培養(yǎng)，培養(yǎng)后24 h，于倒置光學(xué)顯微鏡下拍照（×100）觀察，利用Image J軟件測(cè)量劃痕區(qū)域?qū)挾龋⒂?jì)算細(xì)胞劃痕愈合率。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

運(yùn)用生物學(xué)信息軟件預(yù)測(cè)miRNA375的靶基因?yàn)?PIK3CA（http：//www.targetscan.org/）。以人宮頸癌細(xì)胞基因組DNA為模板，構(gòu)建野生型PIK3CA 3'-UTR（PIK3CA-WT）質(zhì)粒、突變型 PIK3CA 3'-UTR（PIK3CAMut）。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清+1%雙抗）將調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至2×105個(gè)/孔，將PIK3CA-WT、PIK3CA-Mut與miRNA-375模擬基因或?qū)φ漳M基因共轉(zhuǎn)染至SiHa，將細(xì)胞37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)48 h；測(cè)定細(xì)胞熒光素酶活性，海腎質(zhì)粒熒光值作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組測(cè)量數(shù)據(jù)間采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 驗(yàn)證miRNA-375對(duì)PIK3CA的靶向作用

生物信息學(xué)工具網(wǎng)站http：//www.microRNA.org檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-375與PIK3CA 3'-UTR間存在結(jié)合位點(diǎn)（見圖1A）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miRNA-375模擬基因、PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染與對(duì)照模擬基因、PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.985，P=0.000），miRNA-375模擬基因與PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性低于對(duì)照模擬基因與PIK3CA-WT共轉(zhuǎn)染組；miRNA-375模擬基因、PIK3CA-Mut共轉(zhuǎn)染與對(duì)照模擬基因、PIK3CAMut共轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.658，P=0.256），miRNA-375模擬基因與PIK3CA-Mut共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光活性與對(duì)照模擬基因與PIK3CA-Mut共轉(zhuǎn)染無差異（見圖1B）。

2.2 轉(zhuǎn)染 miRNA-375 模擬基因 /miRNA-375 抑制劑對(duì)miRNA-375表達(dá)的影響

PCR結(jié)果顯示，4組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=46.849，P=0.000）。其中，miRNA-375模擬基因組和對(duì)照模擬基因組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因后SiHa細(xì)胞miRNA-375表達(dá)高于對(duì)照模擬基因組；miRNA-375抑制劑組和對(duì)照抑制劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-375抑制劑后SiHa細(xì)胞miRNA-375表達(dá)低于對(duì)照抑制劑組。見圖2。

2.3 miRNA-375對(duì)PIK3CA表達(dá)的影響

圖2 各組細(xì)胞miRNA-375相對(duì)表達(dá)量比較

Western blot結(jié)果顯示，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=94.388，P=0.000）。其中，miRNA-375模擬基因組和對(duì)照模擬基因組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因后PIK3CA蛋白表達(dá)低于對(duì)照模擬基因組；miRNA-375抑制劑組和對(duì)照抑制劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-375抑制劑后PIK3CA蛋白表達(dá)高于對(duì)照抑制劑組。見圖3。

圖3 miRNA-375對(duì)PIK3CA表達(dá)的影響（Western blot）

附表 4組細(xì)胞的增殖活性 （±s）

附表 4組細(xì)胞的增殖活性 （±s）

組別 24 h 48 h 72 h對(duì)照模擬基因組 0.41±0.06 0.65±0.07 0.87±0.05對(duì)照抑制劑組 0.42±0.04 0.66±0.09 0.86±0.07 miRNA-375模擬基因組 0.33±0.05 0.51±0.06 0.65±0.08 miRNA-375抑制劑組 0.49±0.09 0.83±0.10 1.25±0.12

2.4 miRNA-375對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的影響

分別于培養(yǎng)后0、24、48及72 h采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，4組具體OD值見附表。miRNA-375模擬基因組與對(duì)照模擬基因組24、48及72 h的細(xì)胞增殖活性比較，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的細(xì)胞增殖活性有差異（F=38.685，P=0.000）；②miRNA-375模擬基因組與對(duì)照模擬基因組的細(xì)胞增殖活性有差異（F=72.356，P=0.000），miRNA-375模擬基因組與對(duì)照模擬基因組比較，細(xì)胞增殖活性比較低，對(duì)細(xì)胞增殖活性影響較大。③miRNA-375模擬基因組與對(duì)照模擬基因組的細(xì)胞增殖活性變化趨勢(shì)有差異（F=9.865，P=0.000）。

miRNA-375抑制劑組與對(duì)照抑制劑組24、48及72 h的細(xì)胞增殖活性比較，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)間的細(xì)胞增殖活性有差異（F=32.105，P=0.000）；②miRNA-375抑制劑組與對(duì)照抑制劑組的細(xì)胞增殖活性有差異（F=91.283，P=0.000），miRNA-375抑制劑組與對(duì)照抑制劑組比較，細(xì)胞增殖活性比較高，可增加細(xì)胞增殖活性。③miRNA-375抑制劑組與對(duì)照抑制劑組的細(xì)胞增殖活性變化趨勢(shì)有差異（F=12.359，P=0.000）。見圖4。

圖4 各組細(xì)胞增殖活性比較

2.5 miRNA-375對(duì)SiHa細(xì)胞遷移的影響

圖5 各組細(xì)胞遷移能力比較 （×200）

劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=41.459，P=0.000）。其中，miRNA-375模擬基因組和對(duì)照模擬基因組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因后SiHa細(xì)胞遷移能力低于對(duì)照模擬基因組；miRNA-375抑制劑組和對(duì)照抑制劑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-75 抑制劑后SiHa細(xì)胞遷移能力高于對(duì)照抑制劑組。見圖5。

3 討論

miRNA廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控，而其失衡表達(dá)所致的基因轉(zhuǎn)錄異常是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的重要因素，也是促使惡性惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，以miRNA靶向治療為主的新型治療方案為包括宮頸癌在內(nèi)的惡性腫瘤臨床治療提供了新的思路[7-8]。

miRNA-375已被證實(shí)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，并在其中發(fā)揮促癌或抑癌基因作用。SZCZYRBA等[9]研究表明，前列腺癌組織中miRNA-375表達(dá)高于正常前列腺組織（P＜0.05），且miRNA-375表達(dá)高表達(dá)與患者臨床病理特征存在相關(guān)性，提示miRNA-375可能在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用。XU等[10]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中miRNA-375表達(dá)低于正常胃組織（P＜0.05），而過表達(dá)miRNA-375可有效抑制胃癌細(xì)胞侵襲和遷移，其機(jī)制與靶向Janus激酶2（JAK2）有關(guān)，提示miRNA-375可通過靶向調(diào)控下游靶基因抑制胃癌進(jìn)展。MAO等[11]研究顯示，與正常組織相比較，結(jié)直腸癌組織中miRNA-375呈現(xiàn)低表達(dá)（P＜0.05），轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因可使直腸癌細(xì)胞中miRNA-375過表達(dá)，并可通過靶向調(diào)控KLF4抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，提示miRNA-375可能在結(jié)直腸癌中發(fā)揮抑癌作用。而本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因可使宮頸癌細(xì)胞SiHa中miRNA-375表達(dá)增加，同時(shí)使細(xì)胞增殖及遷移能力降低，反之亦然，提示miRNA-375在宮頸癌中發(fā)揮著抑癌作用，與YU等[12]研究結(jié)論一致。

PIK3CA定位于3號(hào)染色體長(zhǎng)臂（3q26.3），大小為34 kb，包括20個(gè)外顯子，其可通過編碼PI3K的p110催化亞單位，促使AKT磷酸化，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，破壞正常細(xì)胞分化、增殖及凋亡等過程，從而促使正常細(xì)胞癌變[13-14]。BERTELSEN等[15]通過檢測(cè)宮頸癌組織中磷酸化AKT和PIK3CA表達(dá)發(fā)現(xiàn)，磷酸化AKT陽性表達(dá)與PIK3CA復(fù)制數(shù)增加呈正相關(guān)，提示PIK3CA可能通過促進(jìn)AKT磷酸化，激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促進(jìn)宮頸癌發(fā)生與發(fā)展。上述研究提示，PIK3CA可能是宮頸癌基因治療中的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-375 模擬基因可使SiHa細(xì)胞中PIK3CA表達(dá)得到抑制，而轉(zhuǎn)染miRNA-375抑制劑則可使PIK3CA表達(dá)提高。故推測(cè)，在宮頸癌中miRNA-375對(duì)PIK3CA具有負(fù)向調(diào)控作用。進(jìn)一步利用基因軟件預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miRNA-375可通過作用于PIK3CA 3'-UTR，實(shí)現(xiàn)對(duì)PIK3CA的靶向作用。此外，本研究還觀察到，轉(zhuǎn)染miRNA-375模擬基因可抑制PIK3CA表達(dá)，且隨著PIK3CA表達(dá)的降低與SiHa細(xì)胞增殖及遷移能力降低，提示過表達(dá)miRNA-375可通過靶向抑制PIK3CA抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移，反之亦然。故推測(cè)，miRNA-375靶向調(diào)控其下游靶基因PIK3CA是其參與宮頸癌增殖及遷移的重要作用機(jī)制。

綜上所述，miRNA-375可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及遷移，其機(jī)制可能與靶向調(diào)控PIK3CA有關(guān)。