張麗娟, 湯興娥, 姚美琪, 劉 怡, 趙翡翠

(新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830000)

準(zhǔn)噶爾烏頭(AconitumsoongoricumStapf.)為毛莨科植物烏頭的干燥塊根[1]，主要分布于我國新疆伊犁地區(qū)和阿勒泰地區(qū),生長在海拔 1 800～2 600 m的山地草地和陽坡[2]，其主要的化學(xué)成分為烏頭堿、雪上一枝蒿乙素、3-脫氧烏頭堿等生物堿[3-5]，具有散風(fēng)寒、除濕、止痛等功效,臨床上多用于風(fēng)濕類疾病的治療[6]。本課題組前期研究表明新疆準(zhǔn)噶爾烏頭的根中含有準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿 、苯甲酰烏頭原堿等化學(xué)成分[7-8]。本研究采用Cell Counting Kit-8(CCK8)法檢測對細(xì)胞增殖抑制的作用、乳酸脫氫酶(LDH)漏出率評價細(xì)胞毒性、流式細(xì)胞術(shù)法檢測細(xì)胞的凋亡情況，評價準(zhǔn)噶爾烏頭對H9c2細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞H9c2細(xì)胞(江蘇凱基生物有限公司，批號JN-3317)。

1.2儀器Smart CeLL HF-90型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司)，HF1200LC型生物安全柜(上海力康儀器有限公司)，TGL-16GB型臺式低速離心機(jī)(上海飛鴿儀器有限公司)，DNP-9272型恒溫箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，DHG 型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，EcLipse TS100-F型熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)，xMarkTM型酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，DK-80型恒溫水浴鍋(上海精宏儀器廠)，YDS-50-125型液氮罐(成都金鳳儀器廠)，BCD-249LCK型-20℃低溫冰箱(合肥美菱公司)， DW-HL388型-80℃低溫冰箱(合肥美菱公司)，Research pLus型手動單道移液器(德國Eppendorf公司)。

1.3試藥胎牛血清(FBS,上海依科賽生物公司,批號FND500)，RPMI1640培養(yǎng)基(美國GIBCO公司,批號C11875500BT)，0.25%胰酶(法國SANOFI-AVENTIS公司，批號SC40020)(美國GIBCO公司,批號25200-056)，PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(北京中杉金橋生物公司,批號ZLI-9062)，LDH檢測試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司，批號 CK12)，青霉素-鏈霉素雙抗(美國GIBCO公司,批號SC30010)，CCK8試劑(北京全式金生物公司,批號FC101-03)，DMSO(美國SIGMA公司,批號D2650)，烏頭堿(成都曼斯特生物技術(shù)有限公司,批號A019)，準(zhǔn)噶爾烏堿、12-表-歐烏堿為實驗室自制。

1.4方法

1.4.1 溶液的制備方法 吸取FBS 5 mL，加入青霉素-鏈霉素溶液5 μL，用RPMI 1640培養(yǎng)基定容至50 mL，混勻即得10%FBS完全培養(yǎng)液，4℃保存，備用。分別量取RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO按(6∶3∶1)混勻，即得凍存液。按照說明書配制10% CCK-8溶液。稱取準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿、12-表歐烏頭堿適量，配制成終濃度為200 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,后續(xù)不同濃度的溶液通過稀釋獲得。

1.4.2 H9c2細(xì)胞的培養(yǎng)方法 取H9c2細(xì)胞用含10%FBS和1%青-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞生長密度，更換培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期后(細(xì)胞密度約占10 cm2培養(yǎng)皿面積的80%～90%)進(jìn)行傳代。超凈臺預(yù)先用紫外燈照射30 min，操作過程均保證無菌。用移液器吸棄培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用無菌PBS溶液沖洗細(xì)胞3次后棄去，加入500 μL胰蛋白酶消化，室溫放置3 min于倒置顯微鏡下觀察，輕晃培養(yǎng)皿如有細(xì)胞脫落，加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打使細(xì)胞完全脫落，放置離心管中1 000 r/min離心3 min,棄上清液，細(xì)胞懸液用完全培養(yǎng)基重懸，平均加于2個培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿加入完全培養(yǎng)液8 mL，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)后換液，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及密度定期進(jìn)行換液或傳代，計數(shù)接種于不同種類孔板，加藥處理。

1.4.3 3種烏頭堿對H9c2細(xì)胞增殖抑制率的測定方法 將H9c2細(xì)胞按“1.4.2”項下培養(yǎng)方法計數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個細(xì)胞/孔)，每孔加入完全培養(yǎng)基0.1 mL，37℃ 、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，棄上清液，考察不同藥物濃度(烏頭堿150、250、400、500、1 000 μg/mL，準(zhǔn)噶爾烏頭堿100、250、400、600、800、1 000 μg/mL，12-表-歐烏堿100.0、400.0、600.0、800、1 000 μg/mL)的細(xì)胞抑制率，每組平行6次，藥物作用24 h后,每孔加入10% CCK-8溶液20 μL,37℃培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀測定450 nm處各組細(xì)胞的吸光度A450，計算細(xì)胞抑制率?？瞻捉M細(xì)胞抑制率為0，其他各組細(xì)胞抑制率=(1-實驗組A450/對照組A450)×100%。

1.4.4 3種烏頭堿對H9c2細(xì)胞毒性作用的測定方法 將H9c2細(xì)胞按“1.4.2”項下方法培養(yǎng)，計數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個細(xì)胞/孔)，實驗分為空白對照組(10%FBS 100 μL/孔)，實驗組(烏頭堿組100、400、500 μg/mL,準(zhǔn)噶爾烏頭堿組100、400、800 μg/mL, 12-表歐烏頭堿組100、400、800 μg/mL)。每孔加入10%FBS 100 μL， 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，加入完全培養(yǎng)液，進(jìn)行藥物處理。各組細(xì)胞經(jīng)給藥后嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，計算細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率[細(xì)胞培養(yǎng)液LDH漏出率(%)=培養(yǎng)液LDH總活性/(培養(yǎng)液LDH總活性+細(xì)胞勻漿液LDH總活性)×100%，式中培養(yǎng)液LDH總活性=培養(yǎng)液LDH活性×培養(yǎng)液的體積；細(xì)胞勻漿液LDH總活性=細(xì)胞勻漿液LDH活性×細(xì)胞勻漿液蛋白含量×細(xì)胞勻漿液LDH體積]。

1.4.5 3種生物堿對H9c2細(xì)胞凋亡的測定方法 將H9c2細(xì)胞按 “1.4.2”項下方法培養(yǎng)，計數(shù)接種于96孔板中(100 μL/孔,即每孔2×105個細(xì)胞/孔)，分為空白對照組(10%FBS 100 μL/孔)，實驗組(烏頭堿組100、400、500 μg/mL, 準(zhǔn)噶爾烏頭堿組100、600、800 μg/mL, 12-表歐烏頭堿組100、400、1 000 μg/mL)，每孔加入10%FBS 100 μL，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌1次，用胰酶消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集細(xì)胞，PBS緩沖液輕懸細(xì)胞并計數(shù)。 取1×104個細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入200 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫下避光孵育15 min，1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入200 mL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入10 μL PI染色液，混勻，避光孵育5 min。細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm， Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測，PI的紅色熒光通過PI通道(FL2)檢測。使用未經(jīng)凋亡誘導(dǎo)處理的正常細(xì)胞作為對照進(jìn)行熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置,計算細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.13種生物堿對H9c2細(xì)胞的抑制作用結(jié)果與空白對照組比較(濃度為0)，實驗各組細(xì)胞體積變小,隨著時間推移細(xì)胞皺縮成橢圓形、球形或其它不規(guī)則形狀，細(xì)胞胞體的折光性下降,細(xì)胞胞漿內(nèi)黑褐色沉積斑點增多。藥物干預(yù)24 h后,細(xì)胞隨藥物濃度的增加逐漸出現(xiàn)死亡脫壁現(xiàn)象,顯微鏡視野中多見無核的細(xì)胞殘片(見圖1-3)。 與空白對照組比較，烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組對H9c2細(xì)胞的抑制率隨著藥物濃度的增大而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組IC50值分別為 562.06、726.80、766.11 μg/mL，見表1。

A: 正常對照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 烏頭堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組

A: 正常對照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 12-表-歐烏堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組

A: 正常對照組 B: 烏頭堿低劑量組 C: 準(zhǔn)噶爾烏頭堿中劑量組 D: 烏頭堿高劑量組

表1 不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿對H9c2細(xì)胞增殖抑制結(jié)果

注：與空白對照組比較，*P<0.05。

2.23種生物堿的乳酸脫氫酶(LDH)漏出率實驗結(jié)果與空白組比較，烏頭堿組、準(zhǔn)噶爾烏頭堿組、12-表-歐烏堿組對H9c2細(xì)胞的細(xì)胞LDH漏出率均隨著濃度的增大而升高，且呈一定的劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 LDH法評價不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表歐烏堿對H9c2細(xì)胞的毒性結(jié)果

注： 與空白對照組比較,*P<0.05。

2.33種生物堿的流式細(xì)胞術(shù)凋亡實驗的結(jié)果與空白對照組比較(濃度為0)，在烏頭堿濃度為400 μg/mL、12-表-歐烏堿濃度為400 μg/mL、準(zhǔn)噶爾烏頭堿濃度為600 μg/mL以上時，細(xì)胞的凋亡差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同濃度烏頭堿、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、12-表-歐烏堿流式細(xì)胞術(shù)凋亡實驗的結(jié)果

注：與空白組比較,△P<0.05。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)天然藥物具有預(yù)防和治療腫瘤的作用,天然藥物已成為最重要的抗腫瘤藥物來源[9-10]。與人體正常組織細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞在形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)上都有不同程度的差異[11-15]。目前對準(zhǔn)噶爾烏頭的化學(xué)成分與藥理作用的研究較少，研究方向主要集中在研究其粗提物的藥理活性等方面，對其單體化合物的研究較少。本研究通過對大鼠心肌細(xì)胞(H9c2細(xì)胞)的細(xì)胞毒性研究發(fā)現(xiàn)，新疆準(zhǔn)噶爾烏頭中準(zhǔn)噶爾烏頭堿、烏頭堿與12-表-歐烏堿這3種生物堿對H9c2細(xì)胞的增殖具有抑制和促凋亡作用,為抗腫瘤藥物提供了心臟毒性安全性參考資料。