張璐瑤 石曉明 杜亞丹 陳亞紅 楊志廣

(河南省周口師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院 466001)

DNA作為遺傳信息的攜帶者和基因表達(dá)的物質(zhì)基礎(chǔ)，在生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、遺傳和變異等生命過(guò)程中起著極為重要的作用。因此，準(zhǔn)確快速、專一性識(shí)別和檢測(cè)生物體內(nèi)的DNA在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著非常重要的意義。目前測(cè)定DNA的分析方法有很多種，其中熒光探針技術(shù)是一種借助熒光顯微鏡在分子水平上進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的重要技術(shù)手段，具有靈敏度高、選擇性好、可視性強(qiáng)、無(wú)損傷、操作方便，在生物學(xué)分析中受到了人們的廣泛關(guān)注和研究。因此，發(fā)現(xiàn)和合成新型多功能監(jiān)測(cè)生物內(nèi)DNA動(dòng)態(tài)變化的熒光探針對(duì)于研究細(xì)胞的生理和病理過(guò)程具有十分重要的意義。本文主要分析了DNA分子熒光探針的研究現(xiàn)狀以及發(fā)展前景。

熒光探針與DNA分子之間主要有三種作用方式： 靜電作用、嵌插作用和溝槽作用。目前用于研究和測(cè)定DNA分子的熒光探針有很多種，主要包括有機(jī)熒光染料類、金屬離子類、金屬離子配合物類、納米粒子類和量子點(diǎn)類等DNA分子熒光探針。

1 有機(jī)熒光染料類熒光探針及其特點(diǎn)

有機(jī)染料是最早發(fā)展起來(lái)研究核酸的熒光探針，主要包括溴化乙啶、菁類染料、菲啶和吖啶類染料、中性紅、甲基藍(lán)以及氟化硼二吡咯(BODIPY)類染料等。這些有機(jī)熒光染料類熒光探針一般會(huì)與DNA分子發(fā)生較明顯的嵌插作用，使體系的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA分子的檢測(cè)，進(jìn)而分析小分子化合物與DNA之間的相互作用方式及作用機(jī)理。Zheng等[1]基于雙咔唑-菁染料設(shè)計(jì)合成了一個(gè)雙光子DNA熒光探針，該探針與DNA結(jié)合后，斯托克斯位移(Stokes shift)較大，雙光子熒光強(qiáng)度增強(qiáng)30倍，具有低毒性、良好的生物相容性和較強(qiáng)的細(xì)胞染色能力，能夠應(yīng)用于活細(xì)胞DNA的雙光子生物熒光成像。Du等[2]基于BODIPY衍生物報(bào)道了一系列檢測(cè)DNA的熒光探針，這些探針靈敏度高、選擇性好、與DNA有較強(qiáng)的親和力，具有較好的活細(xì)胞DNA成像能力。

2 金屬離子類熒光探針及其特點(diǎn)

金屬離子主要涉及稀土離子，如Tb3+和Eu3+等，這是由于稀土離子與DNA具有很強(qiáng)的結(jié)合力，與DNA作用后能夠發(fā)射出稀土離子本身的特征熒光，具有光譜線寬窄、熒光壽命長(zhǎng)、Stokes shift大等優(yōu)良光學(xué)性能，可提供有關(guān)DNA及其組成的信息。Tong等[3]用溴化乙啶探針、紫外、熒光和圓二色光譜研究了百枯草與DNA的相互作用，證實(shí)Tb3+作為熒光探針與DNA鏈上帶負(fù)電荷的磷酸以靜電吸引的方式結(jié)合，對(duì)百枯草與DNA的結(jié)合具有明顯的抑制作用。

3 金屬離子配合物類熒光探針及其特點(diǎn)

由于金屬離子具有獨(dú)特的電子層結(jié)構(gòu)、發(fā)射光譜窄、光化學(xué)穩(wěn)定以及熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，因此得到了廣泛關(guān)注。利用金屬離子配合物熒光探針研究DNA可以從分子水平上探索DNA的結(jié)構(gòu)、染色體變異、藥物的作用機(jī)理以及為新的藥物設(shè)計(jì)提供更有效的理論指導(dǎo)。根據(jù)發(fā)光體的差異可將金屬離子配合物熒光探針?lè)譃榻饘匐x子發(fā)光的和配體發(fā)光的金屬配合物熒光探針。羅黎等[4]合成了氧氟沙星-Tb3+配合物熒光探針，利用熒光光譜、紫外光譜研究了DNA對(duì)氧氟沙星-Tb3+配合物體系的熒光增強(qiáng)效應(yīng)。結(jié)果表明，DNA加入氧氟沙星-Tb3+配合物后，形成了氧氟沙星-Tb3+-DNA三元絡(luò)合物體系，熒光顯著增強(qiáng)，線性范圍為5.0×10-6～1.0×10-4mol/L，檢出限為1.7×10-6mol/L，選擇性好，與DNA的結(jié)合方式主要是溝槽式結(jié)合。楊歡春等[5]分別以La3+、 Eu3+、 Tb3+和Ce3+中心離子，合成了3-羥基-2-萘醛縮氨基硫脲稀土配合物，并通過(guò)紫外光譜、熒光光譜和黏度法等技術(shù)研究了配合物和DNA的相互作用模式。結(jié)果表明，配合物以插入的方式與DNA相結(jié)合。王凱等[6]以5-(4-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉和釕-菲羅啉衍生物為原料，合成了3種釕-菲羅啉卟啉化合物(Por1、 Por2和Por3)，并采用紫外光譜、熒光光譜和圓二色光譜測(cè)試了它們與DNA相互作用的方式。結(jié)果表明，Por1和Por2與DNA的結(jié)合方式均為凹槽的插入模式和外部結(jié)合共存，而Por3則采取自堆積的外部鍵合方式與DNA結(jié)合，該類配合物在光動(dòng)力學(xué)治療中具有誘人的應(yīng)用前景。Wang等[7]基于鄰菲羅啉衍生物設(shè)計(jì)合成了一類檢測(cè)線粒體DNA的雙光子金屬釕配合物熒光探針。該探針具有較好的雙光子吸收性能、良好的生物相容性、選擇性好、自發(fā)熒光小，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞以及活組織中DNA的雙光子生物熒光成像，在生物過(guò)程中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，為直接監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的線粒體DNA提供了一個(gè)有潛力的研究平臺(tái)。

4 納米粒子類熒光探針及其特點(diǎn)

納米金由于其表面積大、穩(wěn)定性好、易于制備、粒徑可控、良好的生物相容性以及獨(dú)特的光電特性等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。董曉婭等[8]以亞甲藍(lán)為電活性標(biāo)記物，利用原位制備的納米金膜和穩(wěn)定的Y型DNA設(shè)計(jì)合成了一種性能優(yōu)異的DNA電化學(xué)生物傳感器。與傳統(tǒng)的傳感器相比，該傳感器具有選擇性好、背景電流小、線性范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，另外，該傳感器也表現(xiàn)出了良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

5 量子點(diǎn)熒光探針及其特點(diǎn)

量子點(diǎn)熒光探針是由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成的能夠接受激發(fā)光產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，粒徑在1～100nm間，具有尺寸效應(yīng)、量子限域效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等性質(zhì)。而且量子點(diǎn)具有摩爾消光系數(shù)大、吸收波長(zhǎng)寬且連續(xù)、熒光發(fā)射波長(zhǎng)窄而對(duì)稱、Stokes shift大、光漂白作用小、光穩(wěn)定好以及顏色可控等特點(diǎn)。因此，量子點(diǎn)作為生物標(biāo)記物具有有機(jī)染料無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。胡先運(yùn)等[9]利用巰基丙酸包覆的InP@ZnS量子點(diǎn)與帶正電的Dured核酸染料通過(guò)靜電結(jié)合，構(gòu)建了一種檢測(cè)DNA的熒光探針。通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移機(jī)理(FRET)，Dured核酸染料-InP@ZnS量子點(diǎn)熒光產(chǎn)生淬滅效應(yīng)，當(dāng)Dured與DNA的特異性結(jié)合后，F(xiàn)RET過(guò)程被打斷，InP@ZnSQDs熒光恢復(fù)。該探針可用于模擬生物生理?xiàng)l件下的DNA檢測(cè)，具有選擇性好、檢測(cè)線性范圍寬、檢測(cè)限低等特點(diǎn)，為核酸的定量分析以及小分子藥物篩選開(kāi)辟了新的途徑。

6 展望

DNA是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞中DNA的含量對(duì)于某些疾病的診斷與治療具有重要意義。本文主要介紹了DNA分子熒光探針的研究現(xiàn)狀，雖然有很多種DNA熒光探針或檢測(cè)方法被報(bào)道，但還存在一些亟待解決的問(wèn)題： ①開(kāi)發(fā)專一性、熒光量子效率高、背景干擾小的DNA熒光探針；②開(kāi)發(fā)具有水容性好、生物透膜性好、生物相容性好以及無(wú)毒性的DNA熒光探針；③合成具有高靈敏度、大雙光子吸收截面及大Stokes shift、能夠?qū)罴?xì)胞和深層組織成像的雙光子DNA熒光探針；④加大探針與DNA分子之間的反應(yīng)機(jī)理以及生物學(xué)機(jī)制研究，為生物研究和醫(yī)學(xué)診斷提供理論基礎(chǔ)。總之，在眾多科學(xué)工作者的努力下，DNA分子熒光探針將會(huì)獲得進(jìn)一步發(fā)展，并在生命科學(xué)領(lǐng)域展現(xiàn)更加廣闊的應(yīng)用用前景。