張 晶 王 鑫 王朋敏 郭 培 常軼可 劉 青 劉惠民 苗國英

皮膚基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma, BCC)在皮膚非黑素腫瘤中發(fā)病率占第一位，近年來，皮膚腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。

Caspase-8是一種天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，幾乎可以引發(fā)所有凋亡級聯(lián)反應(yīng)下游的凋亡相關(guān)因子，誘發(fā)凋亡，是Caspase家族中重要的凋亡啟動因子。P62/SQSTM1是一種多功能泛素化結(jié)合的接頭蛋白，由P62/SQSTM1基因所編碼，參與組成細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)復(fù)合物，廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的自噬、凋亡等多種病理生理過程，常被稱為自噬蛋白。

細(xì)胞惡性增殖以及免疫逃逸是造成腫瘤病情進(jìn)展的關(guān)鍵因素，而在這一過程中細(xì)胞凋亡調(diào)控發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，P62在人類多種惡性腫瘤中存在異常增多，其在非乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量明顯高于正常細(xì)胞[1]。Zeng等研究發(fā)現(xiàn)腦部膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中Caspase-8和P62共同參與細(xì)胞凋亡過程，其中P62主要通過作用于Caspase-8來調(diào)節(jié)Caspase介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)，從而影響細(xì)胞凋亡過程[5]。國外有研究表明，P62通過Cullin3作用于死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death-induring signaling complex，DISC)促進(jìn)聚泛素化，激活細(xì)胞內(nèi)Caspase-8，從而達(dá)到影響機(jī)體Caspase-8的細(xì)胞凋亡的目的[2]。Caspase-8和P62分別為凋亡蛋白和自噬相關(guān)蛋白，在BCC中的表達(dá)及與凋亡和自噬的關(guān)系尚無相關(guān)報道。

本實(shí)驗(yàn)擬采用免疫組織化學(xué)染色法，試圖通過檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8和自噬相關(guān)蛋白P62在皮膚BCC的表達(dá)，探究兩者在BCC的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年3月至2017年5月河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科BCC患者的石蠟組織標(biāo)本共45例作為實(shí)驗(yàn)組，其中，男19例，女26例。年齡17～83歲，平均(61.9±13.9)歲；所有蠟塊均經(jīng)兩位資深病理醫(yī)生復(fù)查并明確診斷，重復(fù)檢查的病例僅將首次資料納入實(shí)驗(yàn)。另選取本院整形外科手術(shù)切除的正常皮膚組織標(biāo)本10例，制成石蠟標(biāo)本作為對照研究，其中，男4例，女6例。年齡40～74歲，平均(59.4±13)歲。實(shí)驗(yàn)組和對照組選取的標(biāo)本均位于頭面部，無其他皮膚病或系統(tǒng)性疾病，術(shù)前無局部治療史。

1.2 主要試劑兔抗人P62單克隆抗體(Abcam公司)工作濃度為1∶500；兔抗人Caspase-8單克隆抗體(Abcam公司) 工作濃度為1∶200；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和PBS粉(pH值7.2～7.4)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(50×)購自上海歌凡生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 組織切片的制備將石蠟組織標(biāo)本4 μm連續(xù)切片，采用免疫組化聚合物酶標(biāo)二抗法，行抗原修復(fù)液水浴修復(fù)抗原，具體步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染。實(shí)驗(yàn)分組：正常皮膚組、BCC組。正常皮膚為對照組。采用0.01 mol/L的PBS(pH值7.4)緩沖液代替一抗作為陰性對照， P62和Caspase-8分別選用口腔鱗癌和扁桃體組織作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定 由至少2名病理科診斷醫(yī)師對免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行評估。在顯微鏡下觀察BCC細(xì)胞和正常表皮著色情況，結(jié)果評估根據(jù)Fromowitz[3]的綜合計分法進(jìn)行，每張陽性切片隨機(jī)選取10個高倍視野(400×)。按陽性細(xì)胞的百分比分級：5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；并按染色強(qiáng)度計分：無染色為0分，淺染色為1分，中度染色為2分，強(qiáng)染色為3分。兩項結(jié)果計分相加計算總得分，可分為四個等級：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6-7分為強(qiáng)陽性(+++)，計算陽性表達(dá)率時，總得分≥2判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，等級資料采用秩和檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Caspase-8在BCC和正常皮膚中的表達(dá) Caspase-8在細(xì)胞中的表達(dá)主要定位于胞質(zhì)。正常皮膚組織中有9例陽性表達(dá)，多呈中度陽性； 20例BCC中Caspase-8呈陽性表達(dá)，且染色強(qiáng)度多為弱陽性和中度陽性。BCC中Caspase-8陽性表達(dá)低與正常皮膚組織有統(tǒng)計學(xué)差異(表1，圖1)。

表1 Caspase-8在BCC和正常皮膚中的表達(dá)

注 ：與正常皮膚相比，Z=-2.711，P<0.05

2.2 P62在BCC和正常皮膚中的表達(dá)P62在細(xì)胞中的表達(dá)多數(shù)位于細(xì)胞質(zhì)，部分位于細(xì)胞核。39例BCC中P62呈陽性表達(dá)，染色自弱陽性至強(qiáng)陽性，以中度陽性染色為主；正常皮膚組織中有4例為陽性表達(dá)，BCC中P62的陽性表達(dá)高于正常皮膚組織(圖1，表2)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 P62在BCC和正常皮膚中的表達(dá)

注：與正常皮膚相比，Z=-2.951，P<0.05

2.3 Caspase-8與P62的相關(guān)性分析 經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析表明，BCC中Caspase-8的陽性表達(dá)水平和P62的陽性表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(表3)。

表3 Caspase-8和P62的相關(guān)性

注：秩相關(guān)性分析，r=-0.322，P<0.05

3 討論

近年來，研究表明腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制以細(xì)胞外途徑為主，其中又以Caspase家族介導(dǎo)的級聯(lián)反應(yīng)為主，凋亡的所有信號通路均需激活Caspase酶系這一終極步驟，誘導(dǎo)激活下游的酶促級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Athar等[4]研究表明，通過調(diào)控Fas的表達(dá)和激活Caspase-8而誘發(fā)細(xì)胞凋亡，可阻止由于紫外線誘導(dǎo)的BCC的發(fā)生。

a：正常皮膚組織中Caspase-8的表達(dá)；b：BCC中Caspase-8的表達(dá)；c：陽性對照中Caspase-8的表達(dá)；d：陰性對照中Caspase-8的表達(dá)；e：正常皮膚組織中P62的表達(dá)；f：BCC中P62的表達(dá)；g：陽性對照中P62的表達(dá)；h：陰性對照中P62的表達(dá)

P62聚集物是細(xì)胞內(nèi)的信號中心，激活TRAF6-NF-KB途徑，可能推動Caspase-8相關(guān)復(fù)合物和下游Caspase途徑凋亡效應(yīng)器的形成。P62在多種腫瘤中超表達(dá)，并與腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移有關(guān)。Caspase-8和P62分別為凋亡蛋白和自噬相關(guān)蛋白，在BCC中的表達(dá)及與凋亡和自噬的關(guān)系尚無相關(guān)報道。曾有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中二者之間存在關(guān)系，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的U87MG細(xì)胞中，經(jīng)給予蛋白抑制劑MG132，抑制細(xì)胞自噬活性，當(dāng)P62蛋白表達(dá)升高，Caspase-8隨之被激活，說明在Caspase-8的活化過程中，P62起到很關(guān)鍵的作用[5]。Xuel等[6]使生長因子缺乏或給予阿糖胞苷處理交感神經(jīng)元時，細(xì)胞的自噬活性發(fā)生明顯提高，并出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象；使用自噬抑制劑處理后，神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)停止在凋亡過程中的活化階段而不再繼續(xù)進(jìn)行，提示凋亡的執(zhí)行依賴于自噬過程。

本研究顯示在BCC組織中，Caspase-8在癌組織表達(dá)明顯低于正常上皮組織，提示BCC組織中存在凋亡異常；而P62在BCC組織中的陽性率明顯高于正常對照，提示Caspase-8和P62的可能與BCC的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。

為進(jìn)一步探討P62在BCC發(fā)生過程中的作用，我們對Caspase-8和P62的表達(dá)相關(guān)性做出了分析。通過統(tǒng)計學(xué)分析，BCC中Caspase-8和P62的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，推測P62可能通過作用于Caspase-8，通過影響其凋亡的泛素化過程，從而影響凋亡下游的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而影響機(jī)體腫瘤的凋亡過程。有研究表明，CDK1誘導(dǎo)的P62磷酸化缺陷會增加腫瘤發(fā)生的概率，并增強(qiáng)細(xì)胞增殖。P62通過參與Ras、MAPK、NF-kB等信號通路的調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤遷移和增殖。

然而至今為止，在皮膚BCC中的P62對凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制的研究資料極為有限，因此對P62在皮膚腫瘤中的作用機(jī)制可做進(jìn)一步研究。