劉 冰 ，張瑞濤 ，李 敏 ，楊 峰 ，楊偉剛 ，于 杰 ，尹桂軍 ，李雪賢 ，吳帥帥 ，

（1.國(guó)家中藥工程膠類研究中心，山東 東阿 252200；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100193）

近些年隨著驢肉市場(chǎng)的不斷升溫，阿膠行業(yè)的持續(xù)發(fā)展，集約化、規(guī)?；捏H養(yǎng)殖也日益增多，驢的繁殖問(wèn)題也受到越來(lái)越多的關(guān)注。在馬屬動(dòng)物中，常見(jiàn)繁殖輔助技術(shù)如人工輸精、定時(shí)排卵等已經(jīng)在馬的繁殖中得到較為普遍的應(yīng)用，而關(guān)于驢人工輸精的輸精體積及輸精劑量等方面的研究、應(yīng)用報(bào)道卻很少。目前，驢繁殖中的輸精方法和輸精劑量多借鑒于馬的繁殖，如用15～25 mL 體積、20 億～25 億個(gè)精子數(shù)進(jìn)行子宮體輸精［1-3］，但越來(lái)越多的研究表明，馬和驢在生理結(jié)構(gòu)等方面存在較大差異［4］。已知精液作為異源物質(zhì)可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)［5］。輸精體積和精子數(shù)過(guò)大可引起子宮體炎癥反應(yīng)的同時(shí)，造成精液浪費(fèi)、成本增加［6-7］，而輸精體積和精子數(shù)過(guò)少又可能導(dǎo)致受孕率降低［7］。基于以上現(xiàn)狀，為探究驢人工輸精的最佳輸精劑量，本試驗(yàn)從輸精體積和有效精子數(shù)兩方面研究其對(duì)母驢情期妊娠的影響，以期在指導(dǎo)驢生產(chǎn)的同時(shí)，為今后更深入地探討驢優(yōu)秀種質(zhì)資源提供必要參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析儀（AndroVisionTM，德國(guó)米尼圖minitube公司），精子密度儀（RS232，法國(guó)卡蘇科技股份有限公司），恒溫?zé)崤_(tái)（CBI0-2000，北京賽百奧科技有限公司），電熱恒溫水槽（DK-8B，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），B超（KX5600，徐州凱信電子股份有限公司），輸精管（法國(guó)卡蘇），無(wú)橡膠塞注射器，等等。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

2017年5—7月在山東東阿國(guó)家黑毛驢繁殖中心（北緯 36°33′，東經(jīng) 116°25′）隨機(jī)選擇 139 頭年齡介于3～7歲的健康能繁德州母驢及精液品質(zhì)良好的6頭種公驢進(jìn)行繁育試驗(yàn)。

1.3 B超檢測(cè)母驢

母驢保定在四柱欄后，掏凈直腸內(nèi)的糞便。手帶涂有潤(rùn)滑劑長(zhǎng)臂手套，選擇5.0 MHz B超機(jī)探頭進(jìn)入直腸，檢測(cè)母驢的卵泡發(fā)育情況。根據(jù)超聲波圖像測(cè)量卵泡直徑，當(dāng)卵泡直徑≥30 mm時(shí)，肌肉注射1.0 mL的GnRH緩釋液，然后輸精［8］。次日檢測(cè)排卵情況，如無(wú)排卵進(jìn)行隔日輸精。記錄排卵時(shí)間，并于排卵15 d后使用B超機(jī)進(jìn)行妊娠診斷。

1.4 精液采集及質(zhì)量檢測(cè)

通過(guò)假陰道法［9］采集種公驢精液，將采集到的精液濾除凝膠部分后置于38℃預(yù)熱的量筒中，讀取精液體積。用精子密度儀測(cè)量精子密度，先加入3 mL生理鹽水于比色皿中，歸零，后于精液液面下中部取120 μL原精液加入比色皿中，混合均勻，測(cè)量密度。同時(shí)，精液液面以下中間部位取7 μL原精液置于預(yù)熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，置于帶有38℃恒溫板的顯微鏡下用計(jì)算機(jī)輔助精子活力分析儀（CASA；Computer-assisted sperm analysis）檢測(cè)精液活力。每個(gè)樣本檢測(cè)5個(gè)視野，記錄前進(jìn)式活力和快速前進(jìn)式活力。檢測(cè)密度≥1.5×108個(gè)/mL，直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)式活力≥0.7的精液用于以下試驗(yàn)。

1.4.1 試驗(yàn)1：一定輸精體積下，輸精精子數(shù)對(duì)驢情期受孕率的影響

Rota等［10］報(bào)道了驢人工凍精輸精中使用INRA96作為凍精基礎(chǔ)稀釋液獲得了較好的妊娠率。本試驗(yàn)根據(jù)采集精液密度添加相應(yīng)體積的INRA96稀釋液使15 mL輸精體積下含有的總精子數(shù)分別為10億、8億和6億個(gè)。置38℃水浴鍋中待用，并在60 min內(nèi)完成發(fā)情母驢子宮體輸精。

1.4.2 試驗(yàn)2：一定精子數(shù)下，輸精體積對(duì)驢情期受孕率的影響

根據(jù)采集精液密度計(jì)算6億個(gè)直線前進(jìn)精子數(shù)、添加相應(yīng)體積的INRA96稀釋液，使輸精體積分別為10、8和6 mL。置38℃水浴鍋中待用，并在60 min內(nèi)完成發(fā)情母驢子宮體輸精。

1.4.3 試驗(yàn)3：在試驗(yàn)1、2得出的最佳妊娠率的輸精有效精子數(shù)、體積的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步降低輸精有效精子數(shù)

根據(jù)采集精液密度添加相應(yīng)體積的INRA96稀釋液，使10 mL輸精體積下含有的總精子數(shù)分別為6億、5億和3億個(gè)。置38℃水浴鍋中待用，并在60 min內(nèi)完成發(fā)情母驢子宮體輸精。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析妊娠差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有效精子數(shù)對(duì)母驢情期受孕率的影響

如圖1所示，15 mL子宮體輸精體積下，10億、8億和6億個(gè)精子數(shù)的受孕率分別為42.86%、37.50%和40.00%，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 15mL子宮體輸精體積、不同精子數(shù)的受孕率比較

2.2 不同輸精體積對(duì)母驢情期受孕率的影響

基于2.1試驗(yàn)結(jié)果，選擇6億個(gè)精子數(shù)下，15、10和5 mL輸精體積的受孕率分別為40.00%、38.46%和11.11%，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)圖 2）。

圖2 6億個(gè)精子數(shù)下不同輸精體積受孕率比較

2.3 低劑量輸精對(duì)母驢情期受孕率的影響

依據(jù)2.1和2.2試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，試驗(yàn)在驗(yàn)證10 mL輸精體積下，6億個(gè)精子數(shù)輸精方式的同時(shí)，進(jìn)一步探究5億個(gè)和3億個(gè)精子數(shù)對(duì)母驢情期受孕率的影響。結(jié)果顯示，6億、5億和3億個(gè)精子數(shù)的受孕率分別為38.46%、25.00%和5.60%（見(jiàn)圖3）。其中，6億個(gè)精子數(shù)的受孕率與3億個(gè)精子數(shù)的受孕率差異顯著（P＜0.05），5億個(gè)精子數(shù)與3億個(gè)精子數(shù)、6億個(gè)精子數(shù)相比受孕率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

圖3 10mL輸精體積下不同精子數(shù)受孕率比較

3 討論

公驢單次射精的總精子數(shù)為2×109～15×109個(gè)精子［11］。精子進(jìn)入子宮后，會(huì)在子宮收縮、宮內(nèi)液體、輸精體積和精子活力等因素的共同作用下，發(fā)生精子向子宮輸卵管結(jié)合處運(yùn)動(dòng)的選擇性。研究表明，輸精4 h后母馬就可在輸卵管建立精子庫(kù)［12］，但目前對(duì)于驢精子輸卵管運(yùn)動(dòng)特性還不清楚。有研究提出，母畜情期多次輸精可對(duì)精子與雌性生殖道的相互有害影響起到“補(bǔ)償性因素”的作用［13］，并可在輸卵管精子庫(kù)儲(chǔ)存足夠數(shù)量，但這種“補(bǔ)償性因素”與母畜受胎的相關(guān)性強(qiáng)度還沒(méi)有明確定義?；谏鲜鲈颍袑W(xué)者提出可在確保一次輸精后輸卵管建立有效精子庫(kù)的前提下，通過(guò)使用外源激素如GnRH和hCG等促進(jìn)母驢排卵發(fā)生［8］，并在距離排卵最近的時(shí)間范圍內(nèi)輸精，縮短精子與子宮內(nèi)膜的相互作用時(shí)間來(lái)提高受孕率［14］。本試驗(yàn)依據(jù)外源激素GnRH促進(jìn)驢排卵規(guī)律［8］，完成試驗(yàn)?zāi)阁H情期內(nèi)輸精1次，排除了多次輸精對(duì)試驗(yàn)的干擾。

人工干預(yù)條件下，母馬子宮體人工輸精通常會(huì)輸入250×106～500×106個(gè)直線前進(jìn)的精子。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輸精劑量在500×106個(gè)時(shí)，即使精液檢測(cè)指標(biāo)出現(xiàn)某些誤差或輸精條件不是很理想時(shí)，也會(huì)獲得可以接受的妊娠結(jié)果。使用高繁殖力公畜精液并將輸精劑量減少到100×106個(gè)也不會(huì)影響輸精妊娠效果［1-3］。但當(dāng)母馬情期子宮體輸精的輸精劑量下降到20×106～60×106個(gè)時(shí)，其情期受孕率會(huì)顯著下降（由75%降低到30%～40%）［15］。雖然馬和驢同屬于馬屬動(dòng)物，但越來(lái)越多的研究表明兩者存在差異，如各自利用其公畜一定量精子進(jìn)行情期人工輸精后發(fā)現(xiàn)，德州母驢情期妊娠率（40%左右）明顯低于母馬［13］。與此同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，如果將母馬、驢的情期輸精劑量增加到1×109個(gè)時(shí)，兩者情期受孕率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別［13］。這一現(xiàn)象也與自然條件下母馬、驢高劑量精液來(lái)確保懷孕相互印證。

相比精子數(shù)對(duì)妊娠率影響來(lái)說(shuō)，輸精體積對(duì)妊娠影響的關(guān)注一直較少。實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，情期使用過(guò)大體積輸精會(huì)因母畜子宮頸腔打開而造成輸精精液外流，同時(shí)易引起母畜子宮炎癥等問(wèn)題［6-7］。對(duì)母馬的研究表明，10～30 mL范圍內(nèi)的輸精體積對(duì)其情期受胎無(wú)影響［7］。本試驗(yàn)的結(jié)果也顯示，5、10、15 mL子宮體輸精后的母驢情期受孕率在各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，配種人員可根據(jù)實(shí)際情況，將采集公畜精液依據(jù)密度、活力、體積，使用稀釋液稀釋到合適密度、體積進(jìn)行子宮體輸精。

在研究中，人們會(huì)依據(jù)不同的精子保存類型來(lái)選擇不同的輸精方式。Vazquez等［16］對(duì)10匹母馬使用宮腔鏡，將20 μL體積、4×106個(gè)精子沉積在子宮輸卵管乳頭部位上進(jìn)行人工授精，最終確認(rèn)3匹母馬妊娠，6匹母馬在輸精后出現(xiàn)了子宮內(nèi)膜炎反應(yīng)。Manning等［17］將含有1×106個(gè)或10×106個(gè)馬精子的0.16～0.25 mL臺(tái)式液直接輸入母馬輸卵管后的妊娠率分別為22%和30%。與Manning不同的是，Morris等［18］將鮮精離心后使用臺(tái)式液稀釋，并使0.03～0.15 mL臺(tái)式液分別含有10×106、5×106、1×106、0.5×106、0.1×106個(gè)或 0.001×106個(gè)直線前進(jìn)的精子，采用宮腔鏡將精液沉積在母馬子宮輸卵管結(jié)合處（未到乳頭）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10×106、5×106個(gè)或 1×106個(gè)精子情期受孕率大于60%，而低于0.5×106個(gè)精子數(shù)的情期受孕率為30%。上述結(jié)果表明，直接將精子輸入輸卵管或繞過(guò)子宮輸卵管結(jié)合處的選擇性屏障不利于母驢受孕。一定輸精精子數(shù)下的輸精部位也會(huì)影響母畜情期受孕率。

本研究結(jié)果表明，對(duì)于繁殖季節(jié)母驢人工輸精體積與精子數(shù)來(lái)說(shuō)，通過(guò)情期子宮體輸精10 mL、6億個(gè)精子可在保證受孕率的同時(shí)，充分發(fā)揮優(yōu)秀種公驢的繁殖潛力和利用價(jià)值。